3種食用菌抗氧化抗發(fā)炎的對(duì)比研究

鄧藝恒，黃永銘，馮亞棟，張書迪，王貴弘，龐海月*

1. 廈門醫(yī)學(xué)院，天然化妝品福建省高校工程研究中心（廈門 361023）；2. 廈門醫(yī)學(xué)院，公共衛(wèi)生與醫(yī)學(xué)技術(shù)系（廈門361023）；3. 福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生物農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建省病原真菌與真菌毒素重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（福州 350002）

福建省是銀耳、猴頭菇、秀珍菇3種食用菌的生產(chǎn)基地，具有地方特色和普及性。銀耳主要活性成分為銀耳多糖（Tremellam），其具有護(hù)肝解毒、養(yǎng)顏?zhàn)o(hù)膚等功能[1-2]。銀耳多糖通過提高血清、肝臟和心臟部位GSH-Px、SOD活性并降低MDA濃度（P＜0.01），顯著提高機(jī)體抗氧化能力[1,3]，且隨著濃度的增加，其抗氧化能力隨之增強(qiáng)[5]。服用銀耳多糖對(duì)炎癥與抗炎系統(tǒng)的激活均有一定抑制作用[4]。猴頭菇是藥食兩用真菌，具有抗衰老、抗癌等功效，常用于治療慢性胃炎、十二指腸與胃潰瘍等疾病[6]。猴頭菇含有70多種次生代謝物，主要包括猴頭多糖、猴頭菌素、猴頭菇酮等[7]。猴頭多糖可提高小鼠肝臟和腦中SOD的活力[8]。猴頭菇酮、猴頭菌素及猴頭多糖具有抗炎作用[9]。秀珍菇，作為一種極具營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的珍稀食用菌，具有滋補(bǔ)身體、安神除煩等生理功能，有著“菇中極品”的美譽(yù)[10-12]。呂建敏等[13]在秀珍菇粉對(duì)H22荷瘤小鼠體內(nèi)抗腫瘤作用研究中證明其具有較好的抑腫瘤作用。其子實(shí)體還包含抗氧化性較強(qiáng)的硒元素[14]。其內(nèi)的多糖物質(zhì)可降低IL-6、TNF-α、NF-B的含量及活性，表明其能夠通過抑制炎癥因子的數(shù)量和活性發(fā)揮抗炎的作用[15]。此次試驗(yàn)旨在研究三者的生理活性，進(jìn)而將其開發(fā)為保健品、食品、功效性化妝品，開拓更廣闊的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

JY92-IIN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝生物科技有限公司）；V-100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（BUCHI Labortechnik AG）；SpectraMax i3x多功能酶標(biāo)儀[美谷分子儀器（上海）有限公司]；FDU-1200冷凍干燥機(jī)（上海愛朗儀器有限公司）。

銀耳、猴頭菇、秀珍菇（福建省古田縣）；馬鈴薯葡萄糖水、酵母粉、麥芽提取粉（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）；瓊脂、硫酸鎂、二甲亞砜（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；無水磷酸二氫鉀、維生素C（VC）、左旋多巴[均為生工生物工程（上海）股份有限公司]；葡萄糖、過硫酸銨、乙二胺四乙酸二鈉、甲醇（均為西隴科學(xué)股份有限公司）；一氧化氮檢測(cè)試劑盒、活性氧檢測(cè)試劑盒（均為上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；DMEM高糖細(xì)胞培養(yǎng)液（蘭杰柯科技有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 3種可食用菌提取物的制備

1.2.1.1 3種可食用菌子實(shí)體提取

將銀耳、秀珍菇、猴頭菇的子實(shí)體剪碎，稱重，分別用95%乙醇和水進(jìn)行超聲破碎。超聲破碎條件：破碎30 s、暫停30 s，功率90%，破碎總時(shí)長(zhǎng)2 h。將破碎后的液體進(jìn)行旋蒸濃縮，濃縮液經(jīng)過冷凍干燥獲得子實(shí)體提取物，分別命名為水提銀耳（WET）、水提猴頭菇（WEH）、水提秀珍菇（WEP）、醇提銀耳（EET）、醇提猴頭菇（EEH）、醇提秀珍菇（EEP）。

1.2.1.2 3種可食用菌菌絲體提取

將銀耳、秀珍菇、猴頭菇分別接種于改良的馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基中，放置于25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待其長(zhǎng)滿后，接種至液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，放置25 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱內(nèi)振蕩培養(yǎng)1周，經(jīng)紗布過濾將菌絲體與菌液分離，菌絲體稱重，分別用95%乙醇和水進(jìn)行超聲破碎。超聲破碎條件：破碎30 s、暫停30 s、功率90%，破碎總時(shí)長(zhǎng)2 h。將破碎后的液體進(jìn)行旋蒸濃縮，濃縮液經(jīng)過冷凍干燥獲得菌絲體提取物，分別命名為水提銀耳（WET）、水提猴頭菇（WEH）、水提秀珍菇（WEP）、醇提銀耳（EET）、醇提猴頭菇（EEH）、醇提秀珍菇（EEP）。

1.2.2 ABTS自由基清除能力的測(cè)定

ABTS自由基清除能力試驗(yàn)方法參照張啟貴等[16]的方法進(jìn)行。取一定量ABTS加入適量蒸餾水中，將其配成7 mmol/L ABTS溶液。另取一定量過硫酸鉀加入蒸餾水，配成140 mmol/L過硫酸鉀溶液。

將440 μL 140 mmol/L過硫酸鉀溶液與25 mL 7 mmol/L ABTS溶液混合，避光反應(yīng)12～16 h，用乙醇稀釋ABTS溶液至吸光度0.700±0.002。將樣品分別稀釋成不同的質(zhì)量濃度（1.00，0.50，0.10和0.02 mg/mL），以維生素C作為陽性對(duì)照，取0.9 mL ABTS溶液與0.1 mL樣品混合，測(cè)定734 nm波長(zhǎng)下的吸光度。ABTS自由基清除率（%）按式（1）計(jì)算。

式中：A0為空白對(duì)照組吸光度；A1為樣品試驗(yàn)組吸光度。

1.2.3 金屬螯合能力的測(cè)定

金屬螯合能力參照歐陽吾樂等[17]的方法進(jìn)行。將樣品分別稀釋成不同的質(zhì)量濃度（1.00，0.50，0.10和0.02 mg/mL），陽性對(duì)照采用乙二胺四乙酸二鈉，依次加入0.1 mL 5 mmol/L菲啰嗪、0.05 mL 2 mmol/L四水氯化亞鐵和1.8 mL甲醇，混合后避光反應(yīng)10 min，測(cè)定562 nm波長(zhǎng)下的吸光度。金屬螯合能力相對(duì)清除率（%）按式（2）計(jì)算。

式中：A0為空白對(duì)照組吸光度；A1為樣品試驗(yàn)組吸光度。

1.2.4 NO清除能力測(cè)定

將樣品分別稀釋成不同的質(zhì)量濃度（1.00，0.50，0.10和0.02 mg/mL），陽性對(duì)照采用維生素C。在EP管中依次加入120 μL樣品、120 μL亞硝酸鈉（0.02 μmol/L）、120 μL Griess Reagent1和120 μL Griess Reagent2，振蕩混合，避光反應(yīng)10 min后在540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。NO相對(duì)清除率（%）按式（3）計(jì)算。

式中：A0為空白對(duì)照組吸光度；A1為樣品試驗(yàn)組吸光度。

1.2.5 細(xì)胞活性氧檢測(cè)

用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液配成RAW264.7細(xì)胞懸液，接種到黑色96孔板，每孔體積100 μL，培養(yǎng)12 h。待細(xì)胞數(shù)量長(zhǎng)到孔的80%左右時(shí)，每孔加入5 μL的樣品和87 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h，加入400 μmol/L氧化氫作用4 h。

活性氧檢測(cè)試劑盒中的DCFH-DA按照1∶1 000的比例用無血清的細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋初始DCFH-DA，使其終濃度為10 mol/L，將上述96孔板的培養(yǎng)液吸光，每孔加入100 μL稀釋后的DCFH-DA，在37 ℃ 5%二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育20 min，用PBS緩沖液稀釋3次，在488 nm激發(fā)波長(zhǎng)和525 nm發(fā)射波長(zhǎng)下檢測(cè)其熒光強(qiáng)度。

1.2.6 細(xì)胞水平NO清除能力測(cè)定

用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液配成RAW264.7細(xì)胞懸液，接種到96孔板，每孔體積100 μL，培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞數(shù)量長(zhǎng)到孔的80%左右時(shí)，每孔加入5 μL的樣品和93 μL的含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，培養(yǎng)2 h，每孔加入2 μL的LPS（1 μg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔取50 μL上清液，加50 μL Griess Reagent1和50 μL Griess Reagent2，測(cè)定540 nm波長(zhǎng)下的吸光度。細(xì)胞水平NO相對(duì)清除率（%）按式（4）計(jì)算。

式中：A0為空白對(duì)照組吸光度；A1為樣品試驗(yàn)組吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

每份樣品都進(jìn)行3次的平行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果取3次平行測(cè)定的平均值，用GraphPad Prism對(duì)結(jié)果進(jìn)行作圖分析。試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用GraphPad Prism對(duì)結(jié)果進(jìn)行作圖分析。組間兩兩比較采用最小顯著差異，用字母a、b、c、d表示其差異性，若字母相同則代表二者沒有顯著性差異，若字母不同則代表二者具有顯著性差異（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 ABTS自由基清除能力的測(cè)定

通過圖1（a）對(duì)水提和醇提的3種可食用菌子實(shí)體提取物對(duì)ABTS自由基清除能力進(jìn)行分析，可以看出隨著可食用菌子實(shí)體提取物濃度的降低，水提和醇提的3種可食用菌子實(shí)體提取物對(duì)ABTS自由基清除能力也降低，其中：水提物中，水提秀珍菇的清除ABTS能力最強(qiáng)；醇提物中，醇提秀珍菇清除ABTS的能力大于醇提猴頭菇大于醇提銀耳。

圖1 不同濃度子實(shí)體（a）和菌絲體（b）提取物對(duì)ABTS陽離子自由基的清除率

通過圖1（b）對(duì)水提和醇提的3種可食用菌菌絲體提取物對(duì)ABTS自由基清除能力進(jìn)行分析，可以看出隨著可食用菌子實(shí)體提取物濃度的降低，水提和醇提的3種可食用菌子實(shí)體提取物對(duì)ABTS自由基清除能力也降低，其中：水提物中，水提秀珍菇的清除ABTS能力最強(qiáng)，水提銀耳與水提猴頭菇次之；醇提物中，3種可食用菌的清除ABTS能力相當(dāng)。這與商佳琦等[18]在分析5種食用真菌中銀耳以及猴頭菇抗氧化性的試驗(yàn)結(jié)果基本吻合。

2.2 金屬螯合能力的測(cè)定

通過圖2（b）對(duì)水提和醇提的3種可食用菌子實(shí)體提取物的金屬螯合能力進(jìn)行分析，可以看出隨著可食用菌子實(shí)體提取物濃度的降低，水提和醇提的3種可食用菌子實(shí)體提取物的金屬螯合能力也隨之降低，其中：水提物中，水提猴頭菇的金屬螯合能力最強(qiáng)，水提秀珍菇次之，水提銀耳最弱；醇提物中，3種可食用菌的金屬螯合能力不分伯仲。

圖2 不同濃度子實(shí)體（a）和菌絲體（b）提取物金屬螯合能力相對(duì)清除率

通過圖2（a）對(duì)水提和醇提的3種可食用菌菌絲體提取物的金屬螯合能力進(jìn)行分析，可以看出隨著可食用菌菌絲體提取物濃度的降低，水提和醇提的3種可食用菌菌絲體提取物的金屬螯合能力也隨之降低，其中：水提物中，水提秀珍菇的金屬螯合能力最強(qiáng)，水提銀耳次之，水提猴頭菇最弱；醇提物中，醇提銀耳的金屬螯合能力最強(qiáng)，醇提猴頭菇次之，醇提秀珍菇最弱。

2.3 生化水平NO清除能力測(cè)定

通過圖3（a）對(duì)水提和醇提的3種可食用菌子實(shí)體提取物生化水平清除NO能力進(jìn)行分析，可以看出隨著可食用菌子實(shí)體提取物濃度的降低，水提和醇提的3種可食用菌子實(shí)體提取物生化水平清除NO能力也隨之降低，只有水提銀耳有清除NO的能力。

圖3 不同濃度子實(shí)體（a）和菌絲體（b）提取物生化水平NO相對(duì)清除率

通過圖3（b）對(duì)水提和醇提的3種可食用菌菌絲體提取物生化水平清除NO能力進(jìn)行分析，可以看出隨著可食用菌子實(shí)體提取物濃度的降低，水提和醇提的3種可食用菌子實(shí)體提取物生化水平清除NO能力也隨之降低，其中：水提物生化水平清除NO能力弱；醇提物生化水平清除NO能力比水提物強(qiáng)，且3種可食用菌菌絲體醇提取物生化水平清除NO能力不相上下。這與Zhang等[19]對(duì)于藥用真菌抗發(fā)炎能力的研究有著異曲同工之妙。

2.4 細(xì)胞活性氧檢測(cè)

通過圖4（a）對(duì)水提和醇提的3種可食用菌子實(shí)體提取物作用細(xì)胞后，從其活性氧熒光強(qiáng)度分析可以看出，隨著可食用菌子實(shí)體提取物濃度的升高，熒光強(qiáng)度隨之降低，細(xì)胞內(nèi)的活性氧也隨之降低。

圖4 不同濃度子實(shí)體（a）和菌絲體（b）提取物作用細(xì)胞的活性氧熒光強(qiáng)度

通過圖4（b）對(duì)水提和醇提的3種可食用菌菌絲體提取物作用細(xì)胞后，從其活性氧熒光強(qiáng)度分析可以看出，隨著可食用菌菌絲體提取物濃度的升高，熒光強(qiáng)度總體上呈也隨之降低，表明此3種食用菌的菌絲體提取物對(duì)活性氧有一定的清除效果。

2.5 細(xì)胞水平NO清除能力測(cè)定

通過圖5（a）對(duì)水提和醇提的3種可食用菌子實(shí)體提取物細(xì)胞水平清除NO能力進(jìn)行分析，可以看出隨著可食用菌子實(shí)體提取物濃度的降低，水提和醇提的3種可食用菌子實(shí)體提取物細(xì)胞水平清除NO能力總體上呈下降趨勢(shì)，水提和醇提的3種可食用菌子實(shí)體提取物細(xì)胞水平清除NO能力都較弱。

圖5 不同濃度菌絲體（a）和子實(shí)體（b）提取物細(xì)胞水平NO相對(duì)清除率

通過圖5（b）對(duì)水提和醇提的3種可食用菌菌絲體提取物細(xì)胞水平清除NO能力進(jìn)行分析，可以看出隨著可食用菌菌絲體提取物濃度的降低，水提和醇提的3種可食用菌菌絲體提取物細(xì)胞水平清除NO能力也隨之降低，水提和醇提的3種可食用菌菌絲體提取物都具有一定的細(xì)胞水平清除NO能力，且醇提物的效果要優(yōu)于水提物的效果。

3 結(jié)論

提取3種均來自福建省古田縣的食用真菌，通過ABTS自由基清除試驗(yàn)、金屬螯合能力測(cè)定試驗(yàn)及細(xì)胞活性氧測(cè)定試驗(yàn)，較全面地反映了水提或醇提的3種可食用菌子實(shí)體與菌絲體的抗氧化能力，無論是水提物還是醇提物，結(jié)果都表明秀珍菇的抗氧化能力最強(qiáng)。通過生化水平NO抑制試驗(yàn)及細(xì)胞水平NO抑制試驗(yàn)證明水提或醇提的3種可食用菌菌絲體與子實(shí)體的抗炎能力，結(jié)果表明水提與醇提的3種可食用菌子實(shí)體與菌絲體都具有一定抗炎效果，除了銀耳以外，其余2種可食用菌子實(shí)體與菌絲體的醇提物抗炎能力大于水提物。陳云波等[20]將銀耳多糖應(yīng)用于化妝品的一系列工藝已經(jīng)較為完備。由此可見這3種食用真菌特別是秀珍菇可作為潛在的天然抗氧化劑應(yīng)用于藥品和食品工業(yè)中。若能進(jìn)一步提純，這3種食用真菌提取物也可應(yīng)用于抗炎的藥品和高端化妝品中。這些都為古田縣農(nóng)產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)升級(jí)提供理論基礎(chǔ)。