小球藻蛋白提取及酶解工藝優化

羅冰

大連職業技術學院（大連 116035）

小球藻（chlorella）在自然界中廣泛存在，具有利用光能的自養能力，并且可以在化學合成或者天然有機質存在的條件下進行人工培養，因為其生長速度快，近些年在多個領域得到重視和利用。小球藻含有多種營養物質和成分，包括多糖類碳水化合物、脂肪、蛋白質、膳食纖維、維生素及其他成分，具有很高的開發價值和利用價值，近年來成為較熱的研究方向[1-4]。蛋白核小球藻因含有較高的蛋白質而得名，達60%以上蛋白質的特點使其達到或者接近魚粉及啤酒酵母的蛋白質水平，高于大豆中含有的粗蛋白含量，因而蛋白核小球藻為一種新型的單細胞蛋白資源，高蛋白含量使其含有豐富的氨基酸，接近標準的氨基酸模式，也為其開發利用提供優勢，具有開發為營養強化劑和高蛋白配料的潛力，并有望用于人類、動物相關的食品和飼料。另有研究表明，蛋白核小球藻蛋白質經過開發后可以得到F值寡肽，具有較強的抗疲勞效果，有輔助治療肝臟疾病的效果，該作用促進小球藻蛋白的開發和應用潛力[5-7]。雖然有一些以小球藻藻粉作為原料的食品生產與銷售，針對小球藻中蛋白質的研究還略微不足，需要加強蛋白的研究與開發，在此基礎上進一步開展活性肽的研究，包括抗氧化肽、抗菌肽等不同的生物活性肽。

活性肽由多種氨基酸按照一定的種類和數量組合而成，數量較多，功能由其氨基酸組成和序列結構決定，因其結構不同而呈現出不同功能，常見的活性肽包括抗氧化肽[8-9]、降血壓肽[10-11]、免疫肽[12]和抗腫瘤肽[13-14]等。試驗以小球藻蛋白提取和制備抗氧化多肽為目標，優化提取工藝和制備條件，為小球藻產品的開發打下基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

小球藻粉（東臺市賜百年生物工程有限公司）；堿性蛋白酶（南京都萊生物科技有限公司）；DPPH（Sigma公司）；HCl、KCl、NaH2PO4、Na2HPO4、Tris堿、NaOH等（均為分析純，國藥集團試劑公司）。

1.2 試驗儀器與設備

臺式高速離心機（TG16.5，上海盧湘儀離心機儀器有限公司）；紫外可見分光光度計（UV-5500PC，上海元析儀器有限公司）；電子天平[PL303，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；水浴鍋（HHS-1，江蘇金壇良友實驗儀器廠）；粉碎機（FW100，天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.3 提取及抗氧化分析

小球藻→堿液提取→工藝優化→小球藻提取液→蛋白含量分析→濃縮→小球藻蛋白濃縮液→酶解制備多肽→工藝優化→酶解液→自由基清除效果分析

1.4 可溶性蛋白含量測定

采用考馬斯亮藍比色法測定。配制一系列不同濃度的可溶性牛血清蛋白溶液，以水為對照，加入5 mL考馬斯亮藍溶液，于595 nm波長處測定吸光度，構建標準曲線方程的標準曲線。樣品蛋白含量根據標準曲線方程進行計算。

1.5 單因素試驗

1.5.1 堿濃度對提取率的影響

稱取100 mg小球藻粉，加入5 mL不同濃度（0.01，0.05，0.10，0.15和0.20 mol/L）的NaOH溶液，提取后測定可溶性蛋白含量，并按式（1）計算提取率。提取采用80 ℃提取20 min，料液比設定為1∶50（g/mL）。

式中：V為提取小球藻的堿液用量，mL；m為小球藻使用量，100 mg。

1.5.2 溫度對可溶性蛋白提取的影響

稱取100 mg小球藻粉，加入5 mL 0.1 mol/L堿液，在60，70，80，90和100 ℃下提取小球藻粉，測定可溶性蛋白含量。設定堿濃度0.1 mol/mL、料液比1∶50（g/mL）、提取時間20 min。

1.5.3 料液比對可溶性蛋白提取的影響

稱取100 mg小球藻粉，設定料液比1∶30，1∶40，1∶50，1∶60和1∶70（g/mL），于80 ℃提取20 min，提取后測定可溶性蛋白含量。

1.6 正交試驗

以單因素試驗得出的最佳料液比、浸提溫度和堿液濃度為中心點，設計正交試驗，因素水平表如表1所示。

表1 小球藻蛋白提取正交試驗因素水平表

1.7 小球藻濃縮液制備

以正交試驗最佳提取工藝制備500 mL小球藻提取液，測定蛋白質含量后，裝入透析袋后，以聚乙二醇5000進行濃縮，獲得50 mL濃縮液待用。

1.8 酶解正交試驗設計

在獲得最佳提取蛋白條件基礎上，結合堿性蛋白酶的性質和預試驗結果，采用正交試驗對堿性蛋白酶酶解小球藻提取濃縮液的最優工藝進行優化，試驗設計表如表2所示。其中，小球藻提取濃縮液用量為5 mL，調節pH后在不同溫度下反應30 min。

表2 酶解正交試驗因素水平表

表3 NaOH溶液濃度對提取效果的影響

正交試驗結果分析以DPPH自由基清除率為指標，確定較佳的酶解條件。

1.9 抗氧化活性測定

抗氧化活性的測定采用DPPH清除法。將酶解樣品（100 μL）加入到DPPH-甲醇溶液中（4 mL 0.1 mmol/L），加入Tris-HCl緩沖液（450 μL 50 mmol/L，pH 7.4），置于25 ℃恒溫水浴30 min，測定517 nm波長處吸光度。以去離子水替代酶解樣品為對照。DPPH自由基清除能力按式（2）計算。

式中：A0為空白對照液的吸光度；A1為樣品測定管的吸光度；A2為樣品本底管的吸光度。

2 試驗結果

2.1 蛋白質標準曲線的繪制

溶性蛋白質含量標準曲線如圖1所示。在樣品測試中以獲得的標準曲線方程進行可溶性蛋白含量計算，y=0.006 4x+0.005（R2=0.998 8）。

圖1 蛋白質含量標準曲線

2.2 堿濃度對可溶性蛋白提取的影響

根據單因素試驗設計，選擇0.01～0.2 mol/L氫氧化鈉溶液進行小球藻粉的提取，其中設定料液比1∶50（g/mL）、提取溫度60 ℃。試驗結果表明，在濃度0.10 mol/L時提取的可溶性蛋白質提取率最高，達到38.89%。NaOH溶液濃度超過0.1 mol/L后，增加堿濃度對提取的結果影響較小，基本穩定在同一水平，考慮到后續堿液處理等問題，因而選擇使用0.1 mol/L堿液進行后續試驗。

2.3 溫度對可溶性蛋白提取的影響

確定NaOH溶液濃度0.1 mol/L、料液比1∶50（g/mL），稱取100 mg小球藻藻粉，加入5 mL堿液，充分振蕩后，在不同溫度下提取20 min，提取后測定可溶性蛋白含量，結果如表4所示。

表4 溫度對蛋白提取效果的影響

表5 料液比對蛋白提取效果的影響

由試驗結果可知，溫度在60～80 ℃時，溫度升高，可溶性蛋白提取量明顯增大，溫度在80～100 ℃時，溫度升高對可溶性蛋白提取影響不大。溫度在80℃左右時，蛋白質提取率最高。

2.4 料液比對可溶性蛋白提取的影響

稱取100 mg小球藻粉，分別加入3，4，5，6和7 mL 0.1 mol/L堿溶液，提取后測定可溶性蛋白含量。

由試驗結果可知，液料比1∶70（g/mL）時，蛋白質提取率最高，主要是因為提取溶液用量增加后，提取溶液中可溶性蛋白質的濃度略低，因為提取溶液量較大，所以溶解出更多的可溶性蛋白質。在實際生產過程中，提取溶液量大影響后續濃縮成本。因此可以選擇溶液量適中的料液比進行提取。

2.5 正交試驗結果

試驗結果表明，料液比對小球藻蛋白質提取的影響最大，其次為溫度，NaOH溶液濃度對提取結果的影響最小。由表6結果可知，最佳的工藝條件為B3C2A2，即料液比1∶70（g/mL），溫度80 ℃，NaOH溶液濃度0.1 mol/L。在此條件下進行重復提取驗證，蛋白質提取率為40.15%，該結果與正交試驗第9組相近。

表6 可溶性蛋白質提取正交試驗結果分析表

2.6 小球藻蛋白的酶解研究

小球藻蛋白提取后采用堿性蛋白酶進行酶解，對DPPH自由基的清除效果如表7所示。

表7 蛋白酶解正交試驗結果

由表7結果可知，A、B、C這3個因素中，A因素對結果的影響最大，其次為B因素，C因素對結果的影響最小。根據正交試驗結果最佳條件為A2B3C2，即pH 9.5、堿性蛋白酶添加量0.07%和反應溫度50 ℃，經過重復試驗驗證，DPPH清除率為50.1%。

3 結論

基于小球藻的營養價值和開發潛力，針對其含量較高的蛋白質進行提取，得到的蛋白提取率與堿濃度、溫度、液料比有關。堿液濃度0.1 mol/L左右時，蛋白質提取率越高。溫度80 ℃左右時，蛋白質提取率越高。液料比1∶70（g/mL）時，蛋白質提取率最高。采用堿性蛋白酶酶解的最佳工藝條件根據正交試驗結果最佳條件為A2B3C2，即pH 9.5、堿性蛋白酶添加量0.07%和反應溫度50 ℃。后續對蛋白質提取和酶解過程均需進一步優化。