竹筍多糖提取工藝優(yōu)化及抗氧化能力研究

李俊杰 ，楊愛國，張文艷 ，王銳，王磊，亢凱杰*

1. 昭通學院化學化工學院（昭通 657000）；2. 云南省高校高原特色功能食品研究重點實驗室（昭通 657000）

竹筍，別名筍、筍子等，大量分布于我國云貴川、廣西、江南地區(qū)。竹筍具備低脂、低糖和多纖維的生物功能特性，營養(yǎng)豐富，能促消化、防便秘，也是減肥良品。而且竹筍還含有大量人體所必需的氨基酸、維生素和礦物質(zhì)等[1]。市面上竹筍產(chǎn)品主要是筍干、酸筍和其他制品，其中酸筍最受人們青睞。據(jù)統(tǒng)計，廣西柳州特色小吃“螺螄粉”因添加酸筍而使其味道獨特走紅全國，因此當?shù)刂窆S的經(jīng)濟價值上漲，成為致富增收的新途徑[2-3]。竹筍除用于鮮食，它活性成分的開發(fā)也備受關注。據(jù)報道，竹筍多糖對人體過多的氧自由基有很好的清除作用，有延緩衰老的作用[4]。食品行業(yè)中，抗氧化能力指數(shù)是衡量食品、果汁和添加劑品質(zhì)的重要標準。周芷冉等[4]對竹筍多糖進行抗氧化研究表明，竹筍多糖在DPPH、羥自由基清除能力等方面均表現(xiàn)出良好的活性。此次研究采用廣西柳州麻竹筍為原料，對竹筍多糖進行提取、分離純化后，對其體外抗氧化能力進行評估，為竹筍資源的拓展和開發(fā)功能性新食品奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

廣西麻竹筍；醋酸鉛、苯酚、濃硫酸、葡萄糖、鹽酸、氫氧化鈉、氯化鈉、冰醋酸、乙醇、鄰苯三酚（均為分析純，天津風船化學試劑有限公司）；福林酚（博林達科技有限公司）；DEAE-52纖維素（北京瑞達恒輝科技發(fā)展有限公司）。

1.2 主要儀器與設備

紫外可見分光光度計（UV-2700，日本島津企業(yè)管理有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（YRE-2000A，鞏義市予華儀器有限公司）；層析柱（16 mm×100 cm，瑞達恒輝有限公司）；離心機（Cenlee20R，湖南湘立科學儀器有限公司）；全波長酶標分析儀（PT-3052C，北京普天新橋技術有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 竹筍多糖提取工藝

竹筍→粉碎→水浸提→濾液→濃縮→除蛋白→離心→上清液→竹筍粗多糖溶液→層析→不同組分竹筍多糖溶液

1.3.2 多糖含量的測定

參照文獻[5]的試驗方法。吸取0～1.0 mL的0.1 mg/mL葡萄糖標準溶液于比色管中，用蒸餾水補充至2.0 mL，加1.0 mL 5%苯酚溶液和5 mL濃H2SO4，搖勻，靜置30 min，于490 nm波長處測定吸光度，并繪制標準曲線，樣品測定同上。

1.3.3 竹筍多糖提取單因素試驗

（1）液料比的影響：稱取各100.0 g竹筍勻漿5份（下同），分別按液料比15∶1，20∶1，25∶1，30∶1和35∶1（mL/g）加入蒸餾水；于95 ℃水浴鍋中浸提4 h，在4 200 r/min下離心8 min，收集上清液，剩余殘渣重復提取1次，合并上清液，濃縮后冷凍干燥，按式（1）計算多糖提取率。

式中：m為多糖質(zhì)量，g；m1為竹筍質(zhì)量，g。

（2）提取時間的影響：樣品按（1）中最優(yōu)液料比，置于95 ℃水浴鍋中分別浸提2，3，4，5和6 h，后續(xù)其他操作同（1）執(zhí)行。

（3）提取溫度的影響：樣品按（1）中最優(yōu)液料比和（2）中最佳時間，分別在80，85，90，95和100℃下提取，后續(xù)其他操作同（1）執(zhí)行。

1.3.4 響應面試驗設計

在單因素試驗基礎上，選擇液料比、提取時間、提取溫度3個自變量，以竹筍多糖提取率為響應值，根據(jù)Design-Expert 8.0.6設計試驗，由Box-Behnken中心組和試驗原理，設計三因素三水平響應面試驗分析。

1.3.5 DEAE-52纖維素分離竹筍多糖

參照Shang等[6]的方法，將DEAE-52纖維素裝入層析柱中，通入蒸餾水洗脫12 h后加入3 mL 3%的竹筍多糖溶液，分別用0.1，0.2和0.4 mol/L的NaCl溶液進行洗脫，控制速度1 min/mL，每10 min收集1管，按照1.3.3測得吸光度，以橫坐標為洗脫管數(shù)，縱坐標為吸光度，得曲線。

1.3.6 竹筍多糖體外抗氧化性的研究

參照文獻[7]對麻竹筍多糖組分的DPPH和羥自由基清除率進行測定。DPPH清除率采用DPPH-乙醇法，以VC作為對照進行；羥自由基清除率采用Fenton反應體系法，以蒸餾水作為空白對照執(zhí)行。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 液料比對多糖提取率的影響

由圖1可知，在液料比15∶1（mL/g）時，竹筍多糖提取率最低，為1.76%，說明竹筍多糖未被充分提取出來，隨著液料比的增加，提取率不斷升高，多糖充分釋放出來，液料比達到30∶1（mL/g）時，提取率達到最高，為2.81%。此時繼續(xù)提高液料比，多糖提取率有下降趨勢，可能因為大量溶劑的加入，使得提取過程中多糖部分流失。張帥等[8]對筍殼多糖進行提取時發(fā)現(xiàn)，液料比超過30∶1（mL/g）時，多糖提取率下降明顯，可能因為過多的溶劑對樣品細胞中某些物質(zhì)的溶出有促進作用，改變細胞滲透壓，不利于多糖的溶出。多糖的提取屬于傳質(zhì)過程，雖然傳質(zhì)的驅(qū)動力固-液兩相可以增加多糖的擴散，擴散達到平衡時，繼續(xù)增大液相比例并未提高產(chǎn)量時反而會降低效能，造成資源浪費。因此可選擇25∶1，30∶1和35∶1（mL/g）的液料比進行后續(xù)試驗。

圖1 液料比對竹筍多糖提取率的影響

2.1.2 提取時間對多糖提取率的影響

由圖2可知，竹筍多糖提取率隨著時間的增加而升高，5 h時提取率最高，達2.88%。繼續(xù)延長時間，竹筍多糖提取率不再升高，提取時間達到6 h時，多糖提取率下降明顯，為2.60%。此變化趨勢與陳蕾俊等[9]研究幾乎一致。雖然長時間的提取更有利于多糖從細胞中滲透出來，但多糖的分子結構在長時間高溫下有可能被水解。因此選擇4，5和6 h進行后續(xù)試驗。

圖2 提取時間對竹筍多糖提取率的影響

2.1.3 提取溫度對多糖提取率的影響

由圖3可知，提取溫度80 ℃時，竹筍多糖提取率最低，為1.74%，可能由于溫度過低，不利于多糖的滲出，隨著溫度的升高，提取率增加，溫度達到90℃時達到峰值2.91%，說明高溫處理有利于多糖的提取。而繼續(xù)升高溫度，提取率略有下降。高溫可以提高多糖的擴散系數(shù)和溶解度，從而提高多糖提取率，而且理論上隨著溫度的升高，多糖提取率會升高，但多糖在長時間高溫條件下，其糖鏈有可能會發(fā)生斷裂而造成多糖分子量下降而被透析除去，使得提取率下降[9]。因此選擇80，85和90 ℃進行后續(xù)試驗。

圖3 提取溫度對竹筍多糖提取率的影響

2.2 竹筍多糖的響應面優(yōu)化結果

2.2.1 響應面試驗設計

在單因素試驗研究下，選擇液料比25∶1，30∶1和35∶1（mL/g），提取時間4，5和6 h和提取溫度80，85和90 ℃，設計響應面試驗因素水平表，在Design-Expert設計試驗下，由Box-Behnken中心組和試驗原理，得出表1因素水平試驗編碼表。

表1 響應面試驗因素水平設計表

2.2.2 回歸模型分析

通過響應面回歸分析，得到竹筍多糖提取率（Y）與液料比、提取時間、提取溫度的二次多項回歸模型。竹筍多糖的提取率可通過試驗數(shù)據(jù)的多元回歸分析，以二階多項式方程估計預測模型：Y=2.86+0.46A+0.23B+0.28C-0.26AB-0.025AC+0.002 5BC-0.32A2-0.17B2-0.21C2，響應面試驗結果如表2所示。

表2 響應面試驗設計及結果

2.2.3 顯著性分析

由表3可知，模型P值＜0.000 1，表示該模型顯著并且具有統(tǒng)計學意義。失擬項P值=0.339＞0.05，表示失擬項差異不顯著，說明該模型相對于純誤差并不顯著，觀測值與預測值得到很好擬合，該多項式模型的準確性和一般可用性足夠。各系數(shù)的顯著貢獻值由F值檢驗的P值決定。有學者研究證明定系數(shù)（R2）和調(diào)整決定系數(shù)（Radj2）評價模型的解釋力，如果兩者的值越接近1，說明模型足以描述觀測值與預測值之間關系。模型相關系數(shù)R2=0.973，該系數(shù)接近1，而擬合模型的決定系數(shù)R2=0.938，Rpred2（預測系數(shù)）=0.750，兩者之差約0.2，說明該模型擬合度較好。對回歸模型系數(shù)的顯著性結果分析可知，一次項A、B、C和二次項A2、C2系數(shù)的顯著性都＜0.01，表明差異極顯著，3個因子對竹筍多糖提取率影響較為敏感，二次項B2系數(shù)接近0.05，差異顯著。通過F值可知，該試驗的3個影響因子對竹筍多糖提取率的影響大小順序為液料比＞提取溫度＞提取時間。根據(jù)響應面建立的模型可預測出竹筍多糖提取率的最佳工藝條件：液料比32.94∶1（mL/g）、提取時間5.23 h、提取溫度88.08 ℃，在該模型設計試驗的預測下多糖提取率為3.11%。為驗證該預測值的可靠性，選擇液料比33∶1（mL/g）、提取時間5.2 h、提取溫度88 ℃進行3次平行試驗，提取率為3.06%，3.08%和3.14%，平均值為3.09%，與預測值接近，表明通過響應面優(yōu)化方法得出的結論可靠，結果預測良好。

表3 響應面模型方差分析

2.2.4 各因素之間的交互作用

理論上響應曲面圖的拋物面開口向下，說明響應結果具有極大值點；響應曲面圖的陡緩程度可反映因素兩兩交互效應的強弱，曲面越陡表示兩因素交互作用顯著，反之則不顯著。由圖4可知，液料比對響應值的影響比提取時間和提取溫度較為顯著，而提取溫度對響應值的影響比提取時間較為顯著，說明各因素之間的具有一定的交互作用，對竹筍多糖提取率有一定影響。3個因素中固定任意1個為零水平，改變其余因素時，隨著其水平的提高，多糖提取率均呈先上升后下降趨勢。液料比和提取時間的曲面圖較陡峭，說明兩者交互作用顯著，而液料比、提取時間與提取溫度的交互作用不顯著。該結果與方差分析結果基本一致。

圖4 各因素交互作用對提取率影響的響應面圖

2.3 分離純化結果分析

由圖5可知，將竹筍粗多糖用DEAE-52纖維素分離純化，經(jīng)不同濃度NaCl溶液洗脫竹筍粗多糖溶液，得到3個組分。經(jīng)0.1 mol/mL NaCl洗脫得到的組分W1，位于第10～第25號試管，0.2 mol/mL NaCl溶液洗脫得到第2、第3組分W2、W3，分別位于第41～第56號和第63～第71號，0.4 mol/mL的NaCl溶液洗脫沒有峰，說明多糖溶液已全部分離出來，計算出得率分別為29.53%，45.24%和9.62%。

圖5 竹筍粗多糖的分離純化

2.4 抗氧化性測定結果分析

由圖6可知，隨著竹筍多糖溶液濃度不斷增加，各組分對羥自由基和DPPH的清除率也隨著增加，但W2組分的竹筍多糖溶液對羥自由基抑制率明顯高于W1、W3組分，其清除率大小為W2＞W(wǎng)1＞W(wǎng)3。W3組分的竹筍多糖溶液對DPPH清除率明顯高于其他組分，清除率大小為W3＞W(wǎng)2＞W(wǎng)1。各組分對羥自由基的清除率明顯優(yōu)于對DPPH的清除率，且W1、W2、W3對羥自由基的清除率的IC50（半數(shù)抑制濃度）分別為0.49，0.64和0.73 mg/mL。根據(jù)Fenton反應原理推測，竹筍多糖有很強的螯合金屬離子或惰化金屬離子的能力，能有效清除羥自由基，這一理論已基本被證實。周芷冉等[4]證實了竹筍多糖對羥自由基的清除率可達80%。張帥等[8]對竹筍殼多糖組分進行抗氧化研究，結果表明多糖組分濃度1.0 mg/mL時，其對羥自由基清除率可達87.70%，說明竹筍殼多糖抗氧化效果明顯。由此可知W1、W2、W3多糖組分對羥自由基和DPPH的清除效果有一定合理性。

圖6 各竹筍多糖組分的抗氧化能力研究

3 結論

采用響應面法優(yōu)化熱水浸提竹筍多糖的工藝參數(shù)，用DEAE-52纖維素層析柱對竹筍粗多糖進行分離得到3組不同組分，并對其進行體外抗氧化能力研究。通過單因素試驗和響應面試驗優(yōu)化得到竹筍多糖提取工藝條件，即液料比33∶1（mL/g）、提取時間5.2 h、提取溫度88 ℃，在該條件下竹筍多糖提取率為3.09%，各因素之間對竹筍多糖提取率有一定影響，而液料比和提取時間兩因素之間交互作用較顯著，影響較大。竹筍多糖分離純化后得到3個組分W1、W2、W3，各組分對羥自由基、DPPH清除率均有一定清除作用，其中：W1組分對羥基自由基、DPPH的清除率分別為80.24%和18.44%；W2的清除率分別為94.01%和36.42%；W3的清除率分別為78.45%和43.17%。試驗通過對竹筍多糖的提取、分離及抗氧化的研究為竹筍資源開發(fā)出功能性食品提供一定理論依據(jù)。