山茱萸中1個新的酚酸類化合物

高洪敏，彭中燦，王利杰，潘雪格，赫 軍，張維庫，續潔琨

山茱萸中1個新的酚酸類化合物

高洪敏1, 2，彭中燦1, 3, 4，王利杰1, 3, 4，潘雪格1, 3, 4，赫 軍4，張維庫3*，續潔琨2*

1. 北京中醫藥大學中藥學院，北京 100029 2. 北京中醫藥大學生命科學學院，北京 100029 3. 中日友好醫院 臨床醫學研究所，北京 100029 4. 中日友好醫院 藥學部，北京 100029

研究山茱萸水提取物部位的化學成分。采用多種色譜技術進行分離純化，通過質譜及核磁共振等方法對化合物進行結構鑒定，并以α-葡萄糖苷酶抑制活性為指標對其降糖活性進行研究。從山茱萸水提取物中分離得到了1個酚酸類化合物，鑒定為2-(2-乙氧基-2-氧乙基)-3,5-二羥基苯基4-羥基苯甲酸酯（1）；α-葡萄糖苷酶抑制活性的半數抑制濃度（median inhibition concentration，IC50）值為7.439 μmol/L。化合物1為新的酚酸類化合物，命名為山茱萸酸酯A，其具有較好的α-葡萄糖苷酶抑制活性。

山茱萸；酚酸類；山茱萸酸酯A；α-葡萄糖苷酶抑制活性；降糖活性

山茱萸又稱“山萸肉”，俗名棗皮，為山茱萸科山茱萸屬植物山茱萸Sieb.的干燥成熟果實[1]，味酸澀，性微溫，主產于陜西、浙江、河南等省，有補益肝腎、澀精固脫的功效[2]。山茱萸的化學成分主要有酚酸類、萜類、黃酮類等[3-5]。藥理學研究表明山茱萸在糖尿病的防治、抗炎、心腦血管的保護、神經保護等方面有較好的活性[3-6]。本課題組前期對山茱萸的化學成分及其生物活性進行了持續和較為系統的研究[3-22]，發現山茱萸水提取物具有良好的抑制α-葡萄糖苷酶活性的作用，結合山茱萸常被作為傳統中醫藥在降糖方劑中的藥材，因此研究其降血糖作用物質基礎具有重要意義。

本研究首先對山茱萸的水提取物進行分離純化，從中分離得到了1個新的酚酸類化合物，鑒定為2-(2-乙氧基-2-氧乙基)-3,5-二羥基苯基4-羥基苯甲酸酯（1），命名為山茱萸酸酯A（圖1）；進而以α-葡萄糖苷酶抑制活性為指標，評價了其降糖活性。

圖1 化合物1的化學結構

1 儀器與材料

Bruker AV-400型核磁共振（Bruker Biospin公司）；Nicolet IS5型紅外光譜儀（Thermo Fisher公司）；Q-Exactive Orbitrap型液相色譜-質譜聯用儀（Thermo Scientific公司）；Agilent 1260 Infinity II型分析液相（DAD檢測器）；島津制備液相（泵：LC-20AR，檢測器：SPD-20A）；WFH-203型三用紫外分析儀；Sartorius-BS223S型電子分析天平；柱色譜硅膠（100～200、200～300目）為青島海洋化工廠生產；硅膠GF254薄層預制板為煙臺化學工業研究所產品；ODS（30～50 μm）為YMC公司生產；Sephadex LH-20型凝膠為Pharmacia公司生產；制備型HPLC色譜柱為Phenomenex Gemini C18色譜柱（250 mm×20 mm，5 μm）；分析型HPLC色譜柱為ES Sonoma C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；酶標儀Spark（Tecan公司）；96孔板（Coster公司）；pNPG N1377（源葉生物，批號S10137）；α-葡萄糖苷酶（Sigma公司，批號G9259）；阿卡波糖（源葉生物，批號S11190）；磷酸鹽緩沖溶液PBS（Coolaber公司）；其余試劑均為分析純（北京化工廠）和色譜純（Honeywell）。

本研究所用山茱萸為2013年11月采自陜西省佛坪縣，由北京中醫藥大學續潔琨教授鑒定為山茱萸屬植物山茱萸Sieb. 的干燥成熟果實，樣品（20131106）目前存放于中日友好醫院臨床醫學研究所。

2 提取與分離

將63 kg干燥的山茱萸果實用水煎煮提取2次（600、500 L），每次2 h。合并提取液，減壓濃縮得到總浸膏約28.9 kg。總浸膏用水混懸后經D101型大孔吸附樹脂柱，依次用水、30%、55%、95%乙醇洗脫。55%乙醇洗脫部位濃縮后得浸膏388 g，將其用硅膠1∶1拌樣，采用硅膠開放柱（200～300目，Φ7.5 cm×118 cm）用氯仿-甲醇梯度洗脫進行分離得到8個流分CO-C1～CO-C8。

流分CO-C4（101 g）經硅膠柱色譜，二氯甲烷-甲醇（100∶0、90∶10、80∶20、70∶30、60∶40、50∶50、40∶60、30∶70）梯度洗脫，TLC點板分析合并為6個流分（C4-1～C4-6），其中流分C4-2～C4-4經點板合并后過ODS柱色譜（甲醇-水1∶9→10∶0）并經TLC點板分析合并得到8個流分（C4-B1～C4-B8）。其中C4-B7過Sephadex LH-20凝膠柱色譜（甲醇-水1∶1→1∶0）經TLC分析合并得到10個流分（B7-A～B7-J），B7-G經Pre-HPLC分離得到化合物1（38.6 mg）[色譜柱Phenomenex Gemini C18（250 mm×20 mm，5 μm）；體積流量3 mL/min；流動相55%甲醇；R＝26 min]。

3 結構鑒定

化合物1：褐色粉末。HR-ESI-MS/331.082 3（[M－H]?，計算值為331.081 2），可確定化合物的分子式為C17H16O7，計算其不飽和度為10。紅外光譜顯示其結構中含有羥基（3415 cm?1）和羰基（1713 cm?1）和苯環（1516 cm?1）等基團。紫外光譜顯示在206 nm和264 nm處有特征吸收。

1H-NMR (400 MHz, Methanol-4) 譜（表1）顯示1個甲基質子信號H1.10 (3H, t,= 7.2 Hz, H-10)；1組亞甲基質子信號H4.00 (2H, q,= 7.2 Hz, H-9), 3.49 (2H, s, H-7)；1組對取代苯上質子信號H8.00 (2H, d,= 8.8 Hz, H-2′, 6′), 6.90 (2H, d,= 8.8 Hz, H-3′, 5′)，提示該化合物存在1個對位取代的苯環結構；1對間位偶合的苯環質子信號H6.27 (1H, d,= 2.4 Hz, H-3), 6.17 (1H, d,= 2.4 Hz, H-5)，提示還存在1個四取代的苯環結構。

13C-NMR (100 MHz, Methanol-4）譜（表1）顯示共17個碳信號，結合HSQC譜確定該化合物含有1個甲基碳信號C14.5 (C-10)；2個亞甲基碳信號C61.9 (C-9), 30.3 (C-7)；2組苯環上碳信號C164.4 (C-4′), 158.7 (C-4), 158.5 (C-6), 152.5 (C-2), 133.6 (C-2′, 6′), 121.5 (C-1′), 111.6 (C-3′, 5′), 107.3 (C-1), 102.3 (C-3), 101.1 (C-5)；2個羰基碳信號C174.0 (C-8), 166.2 (C-7′)。化合物1的波譜數據與已知化合物2--(4-hydroxybenzoyl)-2,4,6-trihydroxy- phenylacetate[23]的波譜數據非常相似，不同之處在于化合物1多了1個乙氧基信號[H4.00 (2H, q,= 7.2 Hz), 1.10 (3H, t,= 7.2 Hz)；C61.9, 14.5]，少了1個甲氧基信號[H3.54 (3H, s, OCH3),C52.4]。

表1 化合物1的1H-和13C-NMR數據(400/100 MHz, Methanol-d4)

Table 1 1H- and 13C-NMR data for compound 1 (400/100 MHz, Methanol-d4)

碳位δHδc 1 107.3 2 152.5 36.17 (d, J= 2.4 Hz)102.3 4 158.7 56.27 (d, J= 2.4 Hz)101.1 6 158.5 73.49 (s)30.3 8 174.0 94.00 (q, J= 7.2 Hz)61.9 101.10 (d, J= 7.2 Hz)14.5 1′ 121.5 2′8.00 (d, J= 8.8 Hz)133.6 3′6.90 (d, J= 8.8 Hz)116.6 4′ 164.4 5′6.90 (d, J= 8.8 Hz)116.6 6′8.00 (d, J= 8.8 Hz)133.6 7′ 166.2

在HMBC譜（圖2）中，H-5 (H6.27) 與C-1 (C107.3), C-3 (C102.3), C-4 (C158.7) 相關，H-3 (H6.17) 與C-1 (C107.3) 相關；同時，H-2′ (H8.00) 與C-7′ (C166.2), C-4′ (C164.4) 相關，H-5′ (H6.90) 與C-1′ (C121.5), C-4′ (C164.4) 相關，結合碳譜、氫譜進一步確定了其結構中存在1個間苯三酚和1個對羥基苯甲酰的結構。另外，H-7 (H3.49) 與C-1 (C107.3), C-2 (C152.5) 和C-8 (C174.0) 相關，H-9 (H4.00) 與C-8 (C174.0), C-10 (C14.5) 相關，H-10 (H1.10) 與C-9 (C61.9) 相關，說明乙氧基與C-8位的羰基相連。綜上所述，該化合物為2-(2-乙氧基-2-氧乙基)-3,5-二羥基苯基-4-羥基苯甲酸酯，經SciFinder文獻數據庫檢索發現該化合物為未見報道的新化合物，命名為山茱萸酸酯A。

圖2 化合物1的主要HMBC

4 降糖活性測定

以4-硝基酚-β--吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl- β--glucopyranoside，PNPG）為底物測定α-葡萄糖苷酶的活性，以阿卡波糖作為陽性對照，在96孔板上進行活性檢測。100 μL PBS緩沖溶液（pH 7.4）中加入20 μL α-葡萄糖苷酶（0.125 U/mL）溶液，以及20 μL不同濃度的化合物1（0.31、0.62、1.25、2.50、5.00、10.00、20.00、40.00 μmol/L），37 ℃恒溫15 min，然后加入20 μL PNPG（2.5 mmol/L），37 ℃恒溫15 min，再加入40 μL的Na2CO3溶液（0.2 mol/L）終止反應，在405 nm波長下測定吸光度（）值[24-26]。按照公式計算α-葡萄糖苷酶抑制率。

抑制率＝[(對照－空白對照)－(樣品－樣品對照)]/(對照－空白對照)

空白對照為加入緩沖液代替樣品的空白對照0 min時的值，對照為對照15 min時的值，樣品對照為加入測試樣品0 min時的值，樣品為加入測試樣品15 min時的值

結果表明，化合物1在20 μmol/L表現出較好的抑制活性，半數抑制濃度（median inhibition concentration，IC50）值為7.439 μmol/L，其效果優于陽性藥阿卡波糖（IC50＝642.4 μmol/L）。

5 結語

本研究從山茱萸水提取物中分離鑒定了1個新的酚酸類化合物山茱萸酸酯A，進一步發現其對α-葡萄糖苷酶活性（IC50＝7.439 μmol/L）明顯優于陽性藥阿卡波糖（IC50＝642.4 μmol/L）。本研究一方面豐富了山茱萸的化學成分多樣性，另一方面為闡明山茱萸的降糖藥效物質奠定了基礎。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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A new phenolic acid from

GAO Hong-min1, 2, PENG Zhong-can1, 3, 4, WANG Li-jie1, 3, 4, PAN Xue-ge1, 3, 4, HE Jun4, ZHANG Wei-ku3, XU Jie-kun2

1. School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China 2. School of Life Sciences, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China 3. Institute of Clinical Medical Sciences, China-Japan Friendship Hospital, Beijing 100029, China 4. Department of Pharmacy, China-Japan Friendship Hospital, Beijing 100029, China

To study on the constituents from water extract of.The water extract ofwas separated and purified by use of various chromatographic techniques, and the structures of the isolates were elucidated by mass spectrometry and nuclear magnetic resonance. The hypoglycemic activity of the compounds using α-glucosidase inhibitory activity as index was also investigated.One phenolic acid compound was isolated from the extract ofand identified as 2-(2-ethoxy-2-oxoethyl)-3,5-dihydroxyphenyl 4-hydroxybenzoate (1). The IC50value of the α-glucosidase inhibitory activity was 7.439 μmol/L.Compound 1 is a new phenolic acid, named cornusester A, with good α-glucosidase inhibitory activity.

Sieb.; phenolic acids; cornusester A; α-glucosidase inhibitory activity; hypoglycemic activity

R284.1

A

0253 - 2670(2023)16 - 5142 - 04

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.16.002

2023-05-30

中央高水平醫院臨床科研業務費（2023-NHLHCRF-CXYW-01，2022-NHLHCRF-YNZJ-01）；國家自然科學基金項目（82073731，82273815，82273809）；中國藥學會以嶺生物醫藥創新基金（CPA-B04-ZC-2021-005）；中國醫學科學研究院基本科研業務費（2022- JKCS-1616）；天然藥物活性物質與功能國家重點實驗室開放基金（GTZK202101，GTZK202206）；中日友好醫院菁英計劃（ZRJY2021-BJ06，ZRJY2021-TD06）

高洪敏（1982—），女，在職碩士，從事中藥物質基礎研究。

張維庫，男，博士，研究員，從事中藥活性成分的發現和新藥開發。Tel: (010)84205766 E-mail: cpuzwk@163.com

續潔琨，女，博士，教授，研究方向為中藥藥理和新藥開發。Tel: (010)84205360 E-mail: xjkbucm@163.com

[責任編輯 王文倩]