腦卒中后吞咽障礙動物模型的研究進展▲

呂永旭 馮衛星 孔靜淵 張 慧 白方方 臧婭楠

(1 陜西中醫藥大學針灸推拿學院,陜西省咸陽市 712046;2 陜西中醫藥大學附屬醫院腦病康復科,陜西省咸陽市 712000)

【提要】 吞咽是人體最重要的功能之一,人體所需要的營養物質大部分是通過吞咽攝入,吞咽功能受損會嚴重影響人們的生活,而吞咽困難是腦卒中常見的后遺癥。構建一個可復制性強、便于操作的腦卒中后吞咽障礙動物模型,對研究該疾病具有非常重要的意義。目前有關腦卒中吞咽障礙的動物模型主要有大腦中動脈短暫性閉塞導致的吞咽障礙模型、結扎雙側頸總動脈制備的吞咽障礙模型,右側腦出血+右側舌下神經損傷誘發的吞咽障礙動物模型。評估動物模型吞咽功能的方法有視頻透視吞咽檢查、肌電圖檢查等。本文就目前有關腦卒中后吞咽障礙動物模型的造模方法和吞咽功能的評估方法進行綜述,為腦卒中后吞咽障礙動物模型的研究提供依據。

腦卒中后約50%的患者會出現吞咽障礙[1-2],這些吞咽障礙的患者中約80%由腦缺血引起,大腦區域(包括大腦中動脈)局部缺血是導致吞咽障礙的一個主要誘因[3-4]。吞咽障礙容易導致患者產生誤吸,引起吸入性肺炎[5-6],因吸入性肺炎死亡的患者數量占急性腦卒中后所有住院死亡患者的31.2%～35.0%[7-8],肺炎是缺血性腦卒中患者和出院后短暫性腦缺血發作患者的主要死亡原因[9]。目前,臨床上主要采用康復療法、替代喂養的補償技術及外科手術來改善吞咽障礙患者的吞咽功能,緩解吞咽障礙對患者造成的影響,避免出現誤吸[10-11]。但吞咽障礙是一種復雜而完整的感覺運動系統的損害[12],其發病機制尚未明確,上述干預措施改善吞咽功能的效果有限,建立腦卒中后吞咽障礙動物模型對研究腦卒中后吞咽障礙的機制,尋找更好的治療方法至關重要。本文就目前有關腦卒中后吞咽障礙動物模型的造模方法進行綜述,為腦卒中后吞咽障礙動物模型的研究提供依據。

1 實驗動物

目前用于構建吞咽障礙動物模型的動物主要有嚙齒類動物、非人靈長類動物和其他哺乳動物[13],其中嚙齒類動物易于控制,尤其是Wistar大鼠較為溫順,經常被用來制備腦卒中后吞咽障礙動物模型[14]。Sprague-Dawley大鼠是由Wistar大鼠培育而成,其繁殖速度快,抗病能力強,也被用來構建腦卒中后吞咽障礙動物模型[15],小鼠體積小、易于控制,也是構建腦卒中后吞咽障礙動物模型的重要動物[16-17]。

2 腦卒中后吞咽障礙動物模型的制備

2.1 單側大腦中動脈短暫性閉塞法構建腦卒中后吞咽障礙動物模型腦 卒中常常會累及一側大腦中動脈[18],且伴有吞咽困難和對側舌無力,伸舌時可觀察到舌頭向對側偏斜,研究認為大腦中動脈阻塞會導致舌力減弱[15],采用大腦中動脈短暫性閉塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)法制備腦卒中后吞咽障礙動物模型可以模擬臨床腦卒中后吞咽障礙的發病過程。具體操作步驟為:采用1.5%～2.0%異氟醚麻醉大鼠,讓其仰臥并將其固定在手術臺上,然后沿著頸部正中線切開皮膚。暴露右側頸總動脈,鈍性分離至頸外動脈分叉,隨后分離頸內動脈,操作過程注意保護迷走神經和喉上神經[19]。用7-0絲線結扎頸總動脈和頸外動脈后,將涂有硅膠的尼龍單絲通過小切口導入右側頸總動脈管腔,然后輕輕穿過頸內動脈,直至尼龍單絲末端堵塞大腦中動脈的起始處,用絲線結扎頸總動脈遠端防止出血。手術結束后,縫合切口,停止麻醉,待大鼠蘇醒并在繁育籠中自由活動90 min后,在異氟醚麻醉下拔除細絲,開通血管,允許再灌注[14]。腦卒中后大腦中動脈梗阻的位置不同對吞咽功能造成的影響也不盡相同,有研究表明,左側大腦半球的梗死可能會影響吞咽的口腔期[4,20],然而,兩個大腦半球的損害均可影響口腔功能。有研究發現,大腦右半球缺血會導致嚴重的吞咽困難并伴有不同程度的咽部損害[21-22],因此吞咽障礙似乎更常見于右半球中風的患者,因為左半球缺血更多的與口腔期功能障礙有關,而右半球缺血與口腔和咽部功能障礙都相關[23-24]。采用MCAO制備腦卒中后吞咽障礙動物模型的研究相對成熟,實驗可操作性強,可復制性高,但必須要明確MCAO與永久性局灶性缺血的病理生理機制不同[25],將動物模型推廣至臨床研究時需注意。

2.2 結扎雙側頸總動脈構建腦卒中后吞咽障礙動物模型 該模型構建的機制為通過結扎雙側頸總動脈(ligature of bilateral common carotid artery,LBCCA)造成腦內血流的持續低流量灌注,以此來誘導吞咽反射。具體操作步驟為:用4%的異氟醚麻醉動物,然后用1.5%的異氟醚混合70%的N2O和30%的O2維持動物的麻醉狀態。通過正中切口,仔細分離雙側頸總動脈與頸部交感神經和迷走神經,結扎雙側頸總動脈。在此過程中,將體溫維持在(37.0±0.5)℃,用激光多普勒血流儀(Laser Tissue Blood Flow Meter FLO-C1;OMEGAWAVE,Inc.)測量左側顳區的腦血流量[26]。Sugiyama等[14]采用LBCCA方法并沒有成功復制出腦卒中后吞咽障礙的動物模型,原因可能是在腦部血供充足的情況下突然誘導雙側頸總動脈產生低流量的灌注,與腦卒中后吞咽障礙的發病過程不一致。腦卒中后吞咽障礙是由于大腦長期持續缺血導致大腦相應功能受損所致,LBCCA雖然也阻斷了雙側頸總動脈的血流供應,但是缺少了長期慢性缺血的病理損傷過程。

腦卒中患者在發病前因各種因素導致腦部供血減少,最終會因缺血缺氧造成大腦的損害,進而出現單側顏面或手臂麻木或無力、突發共濟失調、視物缺失等[27]。因此長期慢性腦血流低灌注是我們關注的重點,其或可成為構建腦卒中后吞咽障礙動物模型的突破口。LBCCA法構建的模型雖然可復制性較高,但相關研究報告相對較少。

2.3 右側腦出血+右側舌下神經損傷構建腦卒中后吞咽障礙動物模型 該方法通過制備Wistar雄性大鼠右側腦出血配合右側舌下神經損傷造成其舌肌癱瘓,從而模擬腦卒中后吞咽障礙的動物模型。具體操作步驟為:給大鼠腹腔注射10%水合氯醛(300 mg/kg)麻醉,剪去大鼠下頜、頸部及頭部正中的被毛,然后將大鼠俯臥位固定于腦立體定位儀上。常規消毒后,沿頭部正中矢狀位切開皮膚約1.5 cm,定位右側尾殼核(矢狀線右側5 mm,前囟后1 mm)后,用顱骨鉆打孔。用微量注射器抽取0.6 μL Ⅶ型膠原酶,垂直進針5 mm后,緩慢推注Ⅶ型膠原酶,注射結束再留針10 min后退針,局部清理消毒、縫合。然后將大鼠置于仰臥位,在頸部正中切開約1.5 cm切口,分離兩側皮膚、皮下組織及腺體,到達肌層后可見位于淺層的二腹肌,將右側二腹肌后腹與周圍組織鈍性分離,即可看見位于二腹肌后腹深面的舌下神經。將舌下神經與周圍組織分離,游離出約5 mm長度的舌下神經,將舌下神經置于止血鉗第6、7齒之間,用止血鉗夾舌下神經約15 s,損傷區域約為2 mm。用生理鹽水沖洗傷口,逐層縫合,切口消毒,手術操作過程中持續用溫熱的生理鹽水浸潤組織,防止組織干燥,術中用烤燈照射以維持大鼠體溫[28]。雖然該模型與腦卒中后吞咽障礙的發病機制有很大的不同,而且無法直觀地判斷造模后是否產生吞咽功能下降或者舌感覺、舌運動的障礙,但與出血性腦卒中造成吞咽障礙有相似的中樞病理基礎,通過測定舌的吞咽功能、形態的變化,可以推測中樞功能是否受到影響。該模型可復制性高,操作成本相對較低。

3 吞咽功能評估

吞咽功能的評估方法在腦卒中后吞咽障礙模型制備中非常重要,由于動物實驗的特殊性,我們無法讓動物配合完成吞咽功能的檢查,所以只能依靠一些客觀的實驗數據或行為學來判斷動物的吞咽功能。選擇一種合適的評估方法不僅能夠有效地評估動物模型制備是否成功,而且還可以節約實驗成本,提升實驗效率。目前主要采用視頻熒光吞咽法(video fluorescence swallowing study, VFSS)、生物信號轉換器、肌電圖等方法觀測大鼠吞咽功能的變化情況。

3.1 VFSS Lever等[16]采用人類VFSS法來測試小鼠吞咽功能。小鼠VFSS方案主要包括三部分:(1)設計獨立的觀察室,讓小鼠可以自由進食和吞咽,且可以不受限制地站在熒光機內的有限空間中;(2)制作一種可以掩蓋口服造影劑的不良味道和氣味并產生足夠放射密度的造影劑,以清晰地觀察小鼠的吞咽情況;(3)逐步測試方案,測試前先讓動物適應測試環境,縮短總測試時間和輻射暴露時間,然后量化每個吞咽階段。即將小鼠置于一個舒適的、低壓力的、自我喂養的檢查環境中,其間評估小鼠的典型進食和吞咽行為。然后將小鼠置于特制的盒子內,服造影劑后的小鼠其吞咽情況可以通過成像技術清晰地反映在計算機上,通過計算機實時記錄小鼠的吞咽數據,最后由觀察人員對每段視頻進行盲法分析以評估小鼠的吞咽功能。該方法可以較為客觀地評估小鼠的吞咽功能,但是相關設備比較昂貴,推廣普及比較困難。

3.2 肌電圖 Kajii等[29]提出可以通過觀察大鼠吞咽頻率結合肌電圖檢查的方法來測量大鼠的吞咽功能。具體操作方法為:用1.3 g/kg烏拉坦對大鼠進行腹腔注射麻醉后,將大鼠仰臥位固定于操作臺上。用加熱墊將大鼠體溫維持在37.0 ℃左右,在頸部腹面做一個正中切口。行氣管插管以維持大鼠呼吸,吞咽動作完成后將另一根管子放入食管下部以排出液體。在硬腭中線固定一根引導管(35 mm,PE205)。沿引導管的輸液管(4 Fr)依次將不同的液體(蒸餾水、10 mmol/L檸檬酸、0.6 μmol/L辣椒素和1 mmol/L L-薄荷醇)注入咽喉區。用程控輸液泵以3.0 μL/s的流速自動輸液10 s,每隔6 min重復輸液一次,連續輸注3～5次。在輸液間隔期間,用生理鹽水沖洗咽喉部,并用抽吸泵清除殘留物,將牙釉質鎳鉻絲制成的成對單極電極插入右側舌骨肌,記錄肌電圖活動信號。肌電圖信號以1 000 Hz的采樣率數字化,以便由數據記錄器進行離線分析,利用頻率為10 Hz的低通濾波器進行全波整流和濾波,將肌電信號轉換為線性包絡。通過肌電信號識別由輸液引起的吞咽反射,記錄輸液過程中的吞咽次數和第一次吞咽潛伏期。其中,輸液10 s內的吞咽頻率記為吞咽次數,從刺激開始到第一次吞咽所需的時間定義為第一次吞咽潛伏期。

3.3 生物信號轉換器檢測法 生物信號轉換器檢測大鼠吞咽功能的具體操作方法為:建模后經大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.35 mL/100 g)麻醉,然后沿著頸部中線切開約1 cm,暴露二腹肌前腹,將一側張力轉換器連接大鼠其中一側的二腹肌前腹,另一側與生物信號轉換器相連。經大鼠口腔插入直徑為0.5 mm的軟管直達舌根部,使用微量注射泵以3 μL/s的速度注入蒸餾水30 s,停止1 min后再次重復操作,重復此操作3次,通過專門的生物信號采集系統記錄相關數據。主要記錄吞咽次數及第一次吞咽發生的時間(吞咽反應時間)[30]。

3.4 飲水計量法 臨床上,需要長期評估腦卒中患者的吞咽功能,以評估治療效果。腦卒中治療學術行業圓桌會議標準建議每隔2～3周為患者做一次吞咽功能的評估,以評估患者的長期療效[31]。Encarnacion等[32]和Freret等[33]認為,在構建腦卒中后吞咽障礙動物模型的最初幾周內,吞咽功能的測試結果欠穩定且不敏感,尤其是損傷輕微的動物模型。基于此,Ahmed等[34]提出直接觀測模型動物的飲水頻率和飲水容積以評估動物的口腔功能,因飲水是動物的本能,幾乎沒有可變性,因此該方法不需要對動物進行特殊訓練。飲水容積表示實驗動物每一次飲水所消耗的液體量,通過計算消耗的總液體量和飲水頻率,即可計算出實驗動物的飲水效率,從而推算出實驗動物的吞咽功能[35]。

飲水計量法具體操作方法為[36-37]:限制動物每日的進水量,使動物處于相對缺水的狀態,然后給動物15 min的自由飲水時間,通過計算動物每1 000次伸舌舔水所飲入的水量,計算出大鼠平均的飲水效率。比較不同模型動物總飲水量、伸舌飲水的頻率、每次飲水的間隔時間等,從而推測出動物的吞咽功能。該試驗方法首次證明大腦中動脈阻塞可導致模型動物飲水功能長期處于低迷的狀態[34],測試的相關設備易制作,可重復性好,易于操作,科研資金不是很充裕的團隊可以選擇使用該法。

3.5 其他 Russell等[38]提出可以通過熒光顯微鏡來觀察老鼠的吞咽功能,具體操作方法為:將花生醬和硫酸鋇的混合物放在飼養老鼠的籠子里,在隨意喂食花生醬混合物期間,在C形臂熒光顯微鏡上以每秒30幀的速度獲得視頻,然后對矢狀面清晰的吞咽動作進行分析。采用Image J軟件評估吞咽功能,包括咀嚼效率和下巴移位等。

4 小結與展望

目前,腦卒中動物模型的造模方法已相對成熟,腦卒中后吞咽障礙動物模型是在腦卒中動物模型的基礎上展開研究的,但目前腦卒中后吞咽障礙發生的機制尚未完全清楚,因此構建一個合理的腦卒中后吞咽障礙的動物模型將有利于研究吞咽障礙發生的病理機制。目前,不管是動物模型構建的研究還是對于吞咽障礙評估方法的研究都有很大的改進空間。