毛竹對(duì)錳脅迫土壤的響應(yīng)研究

蔡啟航，張 宇，羅學(xué)剛,

（1.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 綿陽(yáng) 621000；2.西南科技大學(xué)材料學(xué)教育部工程研究中心，四川 綿陽(yáng) 621000）

【研究意義】錳（Mn）是動(dòng)植物生長(zhǎng)代謝中必需的微量營(yíng)養(yǎng)元素之一，通常在土壤和水中的濃度較低，一般不被認(rèn)為是潛在的有毒元素［1］。過(guò)去的采礦、加工業(yè)和農(nóng)業(yè)等人類活動(dòng)，破壞了Mn 含量的平衡，導(dǎo)致土壤、沉積物和水體中的Mn 污染增加［2］。研究表明，Mn 會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生長(zhǎng)期且隱性的危害，包括帕金森樣癥狀以及生殖系統(tǒng)異常，也對(duì)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生一定影響［3-4］，Mn污染土壤修復(fù)已成為當(dāng)前重要的環(huán)境問(wèn)題［5］。傳統(tǒng)的土壤修復(fù)方法主要為物理化學(xué)方法，如空氣氧化法、氯氧化法和接觸氧化法等［6-9］，這些方法價(jià)格昂貴且易產(chǎn)生二次污染［6-7］。植物修復(fù)是一種經(jīng)濟(jì)、環(huán)保的修復(fù)方法，已被廣泛用于治理重金屬污染土壤。植物提取是植物修復(fù)技術(shù)最常用的方法，利用植物將土壤中的重金屬元素富集到植物地上部分，再通過(guò)收割地上部分進(jìn)行處理，能減少或除去土壤中的重金屬污染物［8-9］。而植物修復(fù)污染土壤的關(guān)鍵在于篩選生物量大、生長(zhǎng)周期短且重金屬富集量高的新品種［10］。

【前人研究進(jìn)展】目前，研究人員已對(duì)耐受Mn 的植物進(jìn)行了廣泛研究，取得良好效果［17］。研究表明，蒼耳（Xanthium sibiricumPatrin ex Widder）等草本植物在污染土壤中顯示出較強(qiáng)的Mn 吸收能力，但其生物量低、生長(zhǎng)速度慢、根系淺，不適合大規(guī)模修復(fù)［11］。毛竹（Phyllostachys pubescens）是一種重要的經(jīng)濟(jì)竹種，我國(guó)種植面積超過(guò)527.76 萬(wàn)hm2，占全國(guó)竹子總面積的70%［12-13］。毛竹具有環(huán)境適應(yīng)強(qiáng)、生長(zhǎng)速度快、用途多、生態(tài)價(jià)值高等特性，地上部分生物量占全竹 90%以上，且根系能在地下遠(yuǎn)距離蔓延生長(zhǎng)，具有吸附重金屬的先天優(yōu)勢(shì)。水培和盆栽試驗(yàn)表明，毛竹在高質(zhì)量濃度重金屬脅迫下無(wú)明顯的壞死和黃化等中毒癥狀［14］。張玲等［15］研究發(fā)現(xiàn)，生長(zhǎng)在鉛（Pb）、鋅（Zn）尾礦周邊的毛竹芽中Pb 含量高達(dá)1 182 mg/kg。Zhang 等［16］在某廢棄礦區(qū)發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)良好的毛竹人工林，礦區(qū)土壤Pb含量高達(dá)286 mg/kg，表明毛竹對(duì)Pb 脅迫具有較強(qiáng)的耐受能力?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前關(guān)于毛竹植物的研究大多在水培或盆栽試驗(yàn)條件進(jìn)行，且只針對(duì)Pb、Zn 等重金屬元素，對(duì)Mn 脅迫土壤的相關(guān)研究較少，無(wú)法充分了解毛竹對(duì)Mn 脅迫土壤的修復(fù)效果。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本文探究標(biāo)準(zhǔn)土柱內(nèi)Mn 脅迫土壤3 年生毛竹的生理響應(yīng)，為Mn 脅迫土壤的治理提供一定理論參考，為重金屬污染土壤的修復(fù)提供新的植物資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

毛竹苗購(gòu)自四川洪雅縣廷富苗木有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)于2018 年6 月開始，通過(guò)五點(diǎn)取樣法采 自西南科技大學(xué)周邊農(nóng)田土作為供試土壤，土壤粘性30.81%，質(zhì)地為中壤。利用便攜式X 射線熒光光譜（PXRF）技術(shù)［17］測(cè)定土壤中Cr、Mn、Fe、Ni、Cu 和Zn 含量分別為85.4、538.9、755.9、58.8、26.3、423.3 mg/kg，超出當(dāng)?shù)赝寥辣尘爸?，本研究主要分析毛竹?duì)上述6 種重金屬的富集特性。毛竹（Phyllostachys pubescens）種植于西南科技大學(xué)試驗(yàn)田長(zhǎng)、寬、深均為1 m 的土柱內(nèi)，每個(gè)土柱裝約1 000 kg 土壤（四川綿陽(yáng)，海拔500 m，年均氣溫14.7～17.3 ℃，年降水量825.8～1 417 mm）。土壤設(shè)置3 個(gè)處理（Mn 濃度分別為1 000、2 000、4 000 mg/kg），以不添加Mn 的土壤為對(duì)照，每個(gè)處理3 次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)面積為1 m2，采用五點(diǎn)法栽種5 株毛竹實(shí)生苗，自然光照和雨水灌溉，3 年后采樣。

1.3 毛竹生長(zhǎng)特性測(cè)定

1.3.1采樣與前處理 2021 年7 月，每個(gè)處理選取長(zhǎng)勢(shì)一致的3 株毛竹，采集毛竹中部（從下往上數(shù)6～7 節(jié)間）的莖與側(cè)枝條發(fā)育較好的葉片，在土壤深度40 cm 處采集根系。清理葉片和莖上雜物、根系上的土壤，放入液氮速凍，置于-80oC 冰箱保存，備用。

1.3.2表觀數(shù)據(jù) 每組分別選取長(zhǎng)勢(shì)一致、葉片大小均一、生長(zhǎng)狀況相同的3 株毛竹進(jìn)行測(cè)定。葉長(zhǎng)、葉寬、株高用卷尺測(cè)量。利用游標(biāo)卡尺測(cè)量竹基部外徑。每個(gè)處理5 次重復(fù)。

1.3.3纖維形態(tài) 利用LDA02 型纖維質(zhì)量濃度分析儀測(cè)定毛竹纖維形態(tài)［18］。選取部分莖桿切成火柴桿大小，置于10 mL 離心管中，使用離析液（10%硝酸與10%鉻酸）浸沒(méi)樣品，室溫放置2 d。將離析后的樣品置于玻璃皿中，用清水洗至無(wú)色后進(jìn)行測(cè)定。每個(gè)處理3 次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)3 個(gè)樣品，每個(gè)樣品測(cè)定5 000 根纖維。

1.3.4毛竹重金屬元素累積量 利用破碎機(jī)將各組干燥后的根、莖和葉粉碎，通過(guò)微波消化法分別提取根、莖和葉中的元素。在微波反應(yīng)系統(tǒng)中將10 mL 硝酸與12 mL 過(guò)氧化氫的混合物對(duì)0.100 g 樣品進(jìn)行消解。微波消解方法：升溫10 min，120 ℃加熱5 min；升溫10 min，150 ℃加熱10 min；升溫10 min，180 ℃加熱30 min；待消解管冷卻后，通過(guò)加熱去酸。用硝酸溶液（體積分?jǐn)?shù)為1%）沖洗3 次，并將溶液轉(zhuǎn)移到50 mL 容量瓶中 。提取物通過(guò)0.45 μm 濾膜過(guò)濾，并在提取后3 d 內(nèi)采用電感耦合等離子體質(zhì)譜法測(cè)定元素質(zhì)量濃度。每個(gè)處理3 次重復(fù)。

1.4 毛竹光合參數(shù)與葉綠素參數(shù)測(cè)定

1.4.1光合參數(shù) 毛竹的光合參數(shù)利用Li-6400 系列便攜式光合作用測(cè)定儀測(cè)定［19］。包括凈光合速率（A，mmol H2O/m2·s）、蒸騰速率（E，mmol H2O/m2·s）、胞間CO2濃度（Ci，ppm）、水分利用率（WUE，g/kg）、葉片溫度（Tleaf，℃）和葉片水汽壓虧缺（VpdL，kPa）。每個(gè)處理9 次重復(fù)。

1.4.2葉綠素含量 采用乙醇丙酮（3∶1，V/V）萃取法測(cè)定葉綠素含量［20］。稱取毛竹葉片0.1 g，加入5 mL色素提取物，快速研磨和浸出5 h（25 ℃）后，用分光光度計(jì)分別在645、663 nm 波長(zhǎng)下測(cè)量。每個(gè)處理5 次重復(fù)。

1.4.3葉綠素?zé)晒鈪?shù) 葉綠素?zé)晒鈪?shù)利用MIN-PAM 儀器（Walz，Inc，德國(guó)）測(cè)定［21］。葉綠素?zé)晒鈪?shù)包括最大熒光產(chǎn)量（Fm）、可變熒光（Fv）、PS II的最大光化學(xué)量子產(chǎn)率（Fv/Fm）、葉綠素?zé)晒庵笜?biāo)Y（II）、相對(duì)電子傳遞速率（ETR）、光合有效輻射（PAR）、光化學(xué)淬滅系數(shù)（qP）和非光化學(xué)淬滅系數(shù)（qN）。每個(gè)處理9 次重復(fù)。

1.5 抗氧化代謝酶 活性與丙二醛含量測(cè)定

使用試劑盒（Solarbio Science &Technology Ltd.，北京）測(cè)量抗氧化酶活性與丙二醛（MDA）含量?？寡趸赴ǔ趸锲缁福⊿OD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）和過(guò)氧化物酶（POD）。每個(gè)處理5 次重復(fù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

利用OmicShare工具對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，對(duì)毛竹代謝的6 種元素（Mn、Fe、Ni、Cr、Zn和Cu）進(jìn)行主成分分析（PCA）和權(quán)重網(wǎng)絡(luò)分析。選擇權(quán)重在0.5～1.0 之間的元素揭示元素間的相互作用。利用SPSS 版本20.0 軟件計(jì)算數(shù)據(jù)的平均值與標(biāo)準(zhǔn)偏差，進(jìn)行單因素方差分析，多重比較采用鄧肯檢驗(yàn)。轉(zhuǎn)移系數(shù)（TF）為地上部的重金屬質(zhì)量濃度除以根的重金屬質(zhì)量濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤中 不同濃度錳脅迫對(duì)毛竹植物學(xué)性狀的影響

如圖1、圖2 所示，與對(duì)照相比，在土壤4 000 mg/kg Mn 脅迫濃度下，毛竹的株高、葉長(zhǎng)、葉寬和基徑分別下降22.6%、25.9%、21.3%和26.7%，毛竹的生長(zhǎng)發(fā)育受到抑制。

圖1 土壤中不同濃度錳脅迫下的毛竹生長(zhǎng)形態(tài)Fig.1 Growth morphology of moso bamboo under different concentrations of Mn stress in soil

圖2 土壤中不同濃度錳脅迫對(duì)毛竹生長(zhǎng)指標(biāo)的影響Fig.2 Effects of different concentrations of Mn stress in soil on growth index of moso bamboo

2.2 土壤中不同濃度錳脅迫對(duì)毛竹纖維形態(tài)的影響

如表1 所示，與對(duì)照相比，在土壤2 000 mg/kg Mn 脅迫濃度下，毛竹的細(xì)小纖維長(zhǎng)度、寬度分別增加15.6%、20.6%，在2 000、4 000 mg/kg Mn 脅迫濃度下，纖維的扭結(jié)指數(shù)分別增加26.6%、47.5%，在1 000 mg/kg Mn 脅迫濃度下，毛竹的扭結(jié)角度和每毫米扭結(jié)數(shù)分別降低22.3%、21.5%，對(duì)毛竹纖維的平均長(zhǎng)度和加權(quán)平均長(zhǎng)度無(wú)顯著影響。

表1 土壤中不同濃度錳脅迫下的毛竹纖維形態(tài)Table1 Fiber morphology of moso bamboo under different concentrations of Mn stress in soil

2.3 土壤中不同濃度Mn 脅迫對(duì)毛竹重金屬富集特性的影響

2.3.1毛竹地上部與地下部對(duì)重金屬的富集特性 如圖3 所示，隨著Mn 脅迫濃度的增加，毛竹地上部與地下部對(duì)Mn 的吸收量逐漸增大。在0、1 000、2 000 和4 000 mg/kg Mn 脅迫濃度下，毛竹對(duì)Mn 的平均富集量分別為1 098.6、2 336.4、3 530.9、5 370.4 mg/kg，對(duì)Mn 的轉(zhuǎn)移系數(shù)分別為1.59、3.83、3.56 和4.17（表2），表明毛竹對(duì)土壤中的Mn 有較強(qiáng)的富集能力。與對(duì)照相比，在土壤4 000 mg/kg Mn 脅迫濃度下，F(xiàn)e、Ni、Cr 和Zn 的轉(zhuǎn)移系數(shù)分別降低38.1%、17.9%、28.5%、47.8%。表明毛竹對(duì)各類重金屬有不同的富集特性，高濃度Mn 脅迫阻礙重金屬元素向毛竹地上部轉(zhuǎn)移。

表2 土壤中不同濃度錳脅迫下毛竹各重金屬轉(zhuǎn)移系數(shù)Table 2 Transfer coefficients of heavy metals in moso bamboo under different concentrations of Mn stress in soil

圖3 土 壤中不同濃度錳脅迫對(duì)毛竹地上部與根部重金屬吸收量的影響Fig.3 Effects of different concentrations of Mn stress in soil on the absorption of heavy metals in the aboveground parts and root of moso bamboo

2.3.2礦物元素的主成分分析和加權(quán)網(wǎng)絡(luò)分析 為闡明Mn 與其他元素的相互作用，對(duì)毛竹礦物元素進(jìn)行主成分分析和加權(quán)網(wǎng)絡(luò)分析。由圖4可知，不同濃度Mn 脅迫下毛竹的礦物元素簇狀位置差異顯著，表明高濃度的Mn 脅迫對(duì)毛竹的礦物代謝有顯著干擾。Mn與Ni、Cu和Fe呈正相關(guān)關(guān)系，與Cr 和 Zn 呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系，與Fe 的相關(guān)性最強(qiáng)?？梢姡邼舛鹊腗n 脅迫導(dǎo)致毛竹的礦物元素代謝發(fā)生變化，是生長(zhǎng)異常的主要原因之一。

圖4 毛竹重金屬元素代謝的主成分（A）和加權(quán)網(wǎng)絡(luò)（B）分析Fig.4 Principal component (A) and weighted network(B) analysis of heavy metal element metabolism in moso bamboo

2.4 土壤中不同濃度Mn 脅迫對(duì)毛竹光合參數(shù)和葉綠素含量的影響

由圖5 可知，與對(duì)照相比，不同濃度Mn 脅迫對(duì)毛竹凈光合速率的蒸騰速率、胞間CO2濃度、葉片溫度和葉片水汽壓虧缺無(wú)顯著影響，而水分利用率顯著降低30.6%，高濃度的Mn 脅迫對(duì)毛竹的光合色素影響不顯著。

圖5 土壤中不同濃度錳脅迫對(duì)毛竹光合參數(shù)的影響Fig.5 Effects of different concentrations of Mn stress in soil on photosynthetic parameters of moso bamboo

2.5 土壤中不同濃度錳脅迫對(duì)毛竹葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

如圖6 所示，不同濃度Mn 脅迫對(duì)毛竹葉片的葉綠素?zé)晒鈪?shù)影響顯著。與對(duì)照相比，在1 000 mg/kg Mn 脅迫下，最大熒光產(chǎn)量、可變熒光量顯著降低11.6%、16.9%。2 000、4 000 mg/kg Mn 脅迫下的光化學(xué)淬滅指數(shù)分別下降19.8%和29.8%，而非化學(xué)淬滅指數(shù)分別下降23.5%和20.7%。PS II 的最大光化學(xué)量子產(chǎn)率、葉綠素?zé)晒庵笜?biāo)、光合有效輻射和相對(duì)電子傳遞速率沒(méi)有顯著變化 。表明高濃度Mn 脅迫使光化學(xué)淬滅能力和非光化學(xué)淬滅能力受到抑制，光合效率降低。

圖6 土壤中不同濃度錳脅迫對(duì)毛竹葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響Fig.6 Effects of different concentrations of Mn stress in soil on chlorophyll fluorescence parameters of moso bamboo

2.6 土壤中不同濃度錳脅迫對(duì)毛竹抗氧化代謝酶活性與丙二醛含量的影響

如表3 所示，與對(duì) 照相比，1 000 mg/kg Mn脅迫濃度下，毛竹的SOD 和CAT 活性顯著增加37.8%、18.4%；2 000 mg/kg Mn 脅迫濃度下，SOD 活性增加15.2%，而POD 活性下降31.5%；在4 000 mg/kg Mn 脅迫濃度下，POD 與CAT 活性分別下降39.4%、22.6%。不同濃度Mn 脅迫對(duì)毛竹的抗氧化代謝酶的活性影響不同，對(duì)MDA含量無(wú)顯著影響。

表3 土壤中不同濃度錳脅迫下的毛竹抗氧化酶活性（U/mg）和丙二醛含量（nmol/g）Table 3 Antioxidant enzyme activity and malondialdehyde content under different concentrations of Mn stress in soil

3 討論

Mn 在植物代謝和生長(zhǎng)過(guò)程中起關(guān)鍵作用［22］，參與光合作用、呼吸作用，蘋果酸酶、硝酸還原酶等酶的生物合成，也是三羧酸循環(huán)中許多酶的激活劑［23］。研究表明，超過(guò)一定濃度范圍，重金屬會(huì)對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生危害。重金屬污染通過(guò)取代必需元素破壞電子傳遞鏈、細(xì)胞水分失衡、光合色素減少、胞內(nèi)CO2含量的減少、葉綠素含量下降等［24］。毛竹作為具有一定修復(fù)能力的植物，具有調(diào)節(jié)機(jī)制，保護(hù)光合作用免受重金屬誘導(dǎo)的脅迫，如信號(hào)通路、運(yùn)輸網(wǎng)絡(luò)、活性氧清除、葉綠素相互轉(zhuǎn)化、基因表達(dá)等［25］。

毛竹是一種生長(zhǎng)快速的植物，高濃度Mn 脅迫對(duì)毛竹的礦物代謝有顯著干擾，損傷毛竹的根系、抑制毛竹葉片的水分利用能力，降低毛竹的生物學(xué)指標(biāo)與生物量等。與對(duì)照相比，4 000 mg/kg Mn 脅迫濃度下，毛竹的株高、葉長(zhǎng)、葉寬和基徑分別下降22.6%、25.9%、21.3%和26.7%。在實(shí)際應(yīng)用中，在毛竹發(fā)育早期可利用分枝、分層、扦插或枝條扦插的無(wú)性繁殖等方法適應(yīng)重金屬脅迫［26］。

細(xì)胞質(zhì)膜是植物受到重金屬脅迫時(shí)的第一道保護(hù)屏障，當(dāng)重金屬濃度超過(guò)植物耐受范圍時(shí)，會(huì)造成氧化應(yīng)激和損害，出現(xiàn)脂質(zhì)過(guò)氧化現(xiàn)象。本研究中，與對(duì)照相比，4 000 mg/kg Mn 脅迫下，POD 活性與CAT 活性分別下降39.4%、22.6%，對(duì)MDA 含量沒(méi)有顯著影響。表明不同濃度Mn 脅迫對(duì)毛竹的抗氧化代謝酶的活性影響顯著，但對(duì)毛竹的膜系統(tǒng)的過(guò)氧化損傷有限。毛竹的存活率與生長(zhǎng)狀況較好，沒(méi)有葉片枯死黃化、莖稈干枯損傷等現(xiàn)象，說(shuō)明毛竹具有很強(qiáng)的重金屬耐受性。Wang 等［27］研究發(fā)現(xiàn)，水培試驗(yàn)中，Mn 脅迫下欒樹葉片光合作用下降，導(dǎo)致植物生物量和葉綠素含量顯著下降。

與對(duì)照相比，在4 000 mg/kgMn 脅迫濃度下的光化學(xué)淬滅指數(shù)下降29.8%，而非化學(xué)淬滅指數(shù)下降20.7%，表明高濃度Mn 脅迫抑制毛竹光合作用的效率。光合作用期間產(chǎn)生的能量會(huì)用于防御重金屬的誘導(dǎo)產(chǎn)生的氧化應(yīng)激，以維持自身的生長(zhǎng)發(fā)育［28］。在后續(xù)應(yīng)用中可以調(diào)控毛竹的生長(zhǎng)條件，如增加光照強(qiáng)度、增加CO2濃度、保持土壤水分等，用于增加毛竹的生物量，使之達(dá)到預(yù)期的修復(fù)效果［29］。

本研究中，毛竹雖沒(méi)有達(dá)到超富集植物的標(biāo)準(zhǔn)，但在4 000 mg/kgMn 脅迫濃度下，對(duì)Mn 的轉(zhuǎn)移系數(shù)為4.17，表明毛竹具有較強(qiáng)的富集能力［30］。而毛竹纖維形態(tài)數(shù)據(jù)表明，Mn 脅迫不會(huì)影響毛竹的纖維長(zhǎng)度，修復(fù)后毛竹依舊能作為紙漿加工的原材料。今后，我們將進(jìn)一步從生理層面深入研究毛竹對(duì)Mn 的耐受性，探討重金屬在毛竹體內(nèi)的轉(zhuǎn)移機(jī)制，揭示毛竹對(duì)重金屬的解毒機(jī)理?？梢詫⒚衽c其他超富集植物聯(lián)合，修復(fù)更多的目標(biāo)重金屬土壤，提升空間利用率。還可探究在添加EDTA、槐糖脂等外源物質(zhì)后毛竹對(duì)重金屬污染的響應(yīng)機(jī)制，為實(shí)現(xiàn)植物修復(fù)研究領(lǐng)域提供新的思路［31-33］。

4 結(jié)論

本文以毛竹為研究對(duì)象，進(jìn)行3 年Mn 脅迫土柱試驗(yàn)，對(duì)毛竹植物學(xué)性狀、光合參數(shù)、葉綠素?zé)晒鈪?shù)等指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，闡明毛竹在不同濃度Mn 脅迫下的毒性響應(yīng)機(jī)制。結(jié)果表明，高濃度的Mn 脅迫對(duì)毛竹的植物學(xué)性狀指標(biāo)有一定抑制作用，顯著降低毛竹光化學(xué)淬滅能力和非光化學(xué)淬滅能力，影響毛竹的相關(guān)抗氧化代謝酶的活性。但在4 000 mg/kgMn 脅迫下毛竹依舊生長(zhǎng)，沒(méi)有葉片枯死黃化等現(xiàn)象，對(duì)Mn 的轉(zhuǎn)移系數(shù)達(dá)到4.17，對(duì)Mn 脅迫土壤有很好的富集作用。毛竹易于栽培、生物量大、環(huán)境適應(yīng)能力較強(qiáng)，可作為一種新的Mn 脅迫土壤的植物修復(fù)品種。該研究為今后重金屬污染治理的應(yīng)用與植物修復(fù)領(lǐng)域的研究提供參考。