復方植物精油對黃羽肉雞生產性能和腸道菌群的影響

何佳楠，何叔年，康樺華，符德佳，樊志紅，曾憲軍，陳 杰，彭新宇

（1.仲愷農業工程學院動物科技學院，廣東 廣州 510225；2.廣東省農業科學院動物衛生研究所/廣東省畜禽疫病防治研究重點實驗室/農業農村部獸用藥物與診斷技術廣東科學觀測實驗站/廣東省中獸藥工程技術研究中心，廣東 廣州 510640；3.廣州市江豐實業股份有限公司，廣東 廣州 510510；4.廣州市江豐實業翁源有限公司，廣東 韶關 512600）

【研究意義】飼用抗生素可提高畜禽生產性能、減少疾病，但其廣泛應用導致畜禽產品藥物殘留問題，也促使細菌耐藥性的產生，嚴重威脅食品安全和人體健康。因此，世界各國對飼用抗生素紛紛采取限制措施。根據農業農村部要求，從2020 年7 月1 日起，我國飼料生產企業必須停止生產含有促生長類藥物飼料添加劑（中藥類除外）的商品飼料。這標志著我國畜牧業發展進入綠色發展階段，“禁抗、減抗、限抗”已成為畜牧業高質量發展的必然趨勢，研究抗生素替代品是行業發展的迫切需求。

【前人研究進展】目前抗生素替代品的研究主要集中在天然植物（包括中草藥）、益生菌和酸化劑等方面。其中，植物提取物是通過物理、化學等方式從植物中提取的單一或混合的化合物，具有促生長、抗氧化、抗菌和增強免疫等功效［1］。植物精油作為一類重要的植物提取物，是植物的天然揮發性油類，通常由幾十種不同的化學物質組成，含量較高的幾種化學物質可占總量的70%［2-3］，這些成分對植物精油的生物學功能影響極大。目前關于植物精油抑殺病原微生物、抗氧化、消炎等研究很多［4］。據報道，肉豆蔻與肉豆蔻衣精油對大腸桿菌、葡萄球菌等具有抑菌作用［5］，羅勒精油可提高腸道內溶菌酶的活性［6］。此外，植物精油可以提高肉雞的抗氧化能力，如在肉雞日糧中添加鼠尾草精油和迷迭香精油，其胸肌和腿肌的抗氧化能力更好，膽固醇氧化產物更低［7］。研究表明，肉豆蔻精油能提高鐵離子的還原能力，羅勒精油能使氧化酶mRNA 表達降低［8-9］。

腸道微生物是動物腸道中共生的一個龐大的微生物族群，細菌是其最重要的組成部分。研究表明，超過100 萬種微生物在肉雞腸道定殖，其基因相當于肉雞全基因組的40～50 倍［10］。正常肉雞的腸道菌群具有免疫屏障、營養代謝和促進生長發育等作用，是雞生理功能中不可或缺的一環，因此腸道菌群平衡對肉雞健康具有重要意義［11］。研究表明，肉雞的生長性能不同，其腸道菌群組成也存在顯著差異［12-13］，肉雞的生產性能與腸道菌群密切相關。

【本研究切入點】前期研究發現，肉豆蔻和羅勒復方精油對雞產氣莢膜梭菌具有良好的體外抑菌作用，在雞壞死性腸炎的人工發病模型試驗中表現出良好的預防效果［14］。但該復方精油對規模養殖黃羽肉雞的應用效果還不清楚?！緮M解決的關鍵問題】本研究開展黃羽肉雞規模養殖試驗，在日糧中添加肉豆蔻和羅勒復方精油預混劑，評價該復方精油對集約化飼養黃羽肉雞主要生產性能指標的影響；并對腸道菌群16S rDNA V3～V4可變區進行高通量測序，分析肉豆蔻和羅勒復方精油對肉雞腸道菌群的影響，探討其作用機制，為肉豆蔻和羅勒復方精油在黃羽肉雞生產中應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試的復方精油預混劑（以下簡稱“復方精油”）由肉豆蔻精油和羅勒精油配制（含精油20%），由廣東省農業科學院動物衛生研究所提供。

供試的黃羽肉雞為江村黃雞商品雛雞（1 日齡，♀），由廣州市江豐實業股份有限公司提供。

試驗用基礎日糧為玉米-小麥-豆粕-菜粕型日糧，參照國家農業行業標準《黃羽肉雞營養需要量》（NYT/3645-2020）進行配制，為顆粒狀配合飼料。日糧組成和營養水平見表1。

表1 日糧組成和營養水平Table 1 Composition and nutrient level of diets

1.2 試驗分組與飼養管理

隨機將3 942 只1 日齡黃羽肉雞分為空白對照（EOCON）、復方精油低劑量（EOL）和復方精油高劑量（EOH）3 個處理組，分別飼喂基礎日糧、添加0.025%和0.05%復方精油預混劑的基礎日糧 。每個處理6 個重復，每個重復219 只黃羽肉雞。

試驗于2020 年7—9 月在廣州市江豐實業股份有限公司花都雞場進行。試驗期為60 d，肉雞全程自由采食，由乳頭式飲水器供水。1～35 日齡在育雛舍飼養，35 日齡后轉移至育成舍。每天記錄各處理組的飼料消耗量、健康狀態和死亡情況等。

1.3 生產性能指標測定

60 日齡時統計黃羽肉雞生產性能相關數據，包括各處理組的合格雞體質量（＞1.3 kg）、合格存活個體數、死淘數以及飼料消耗量。計算各處理組肉雞的平均合格品出欄率、平均日采食量、平均體質量以及料肉比等。

合格品出欄率（%）=出欄合格活體數/219×100

1.4 腸道菌群分析

60 日齡時，每個處理組隨機抽取5 只雞，脫頸處死，無菌操作取空腸（以其卵黃蒂為起點，上下各5 cm）和盲腸內容物，干冰暫存，隨后送到實驗室-80 ℃冰箱中保存備用。

采用天根生物科技有限公司的糞便基因組DNA 提取試劑盒，按說明書提取腸道內容物細菌DNA。根據細菌16S rDNA V3～V4可變區進行引物設計，引物序列為：338F 5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3' 和806 R 5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'。

PCR 反應體系（20 μL）：4 μL 5×FastPfu 緩沖液，2 μL 2.5 mmol/L dNTPs，0.4 μL 上游引物，0.4 μL 下游引物，0.4 μL FastPfu 聚合酶，0.2 μL BSA，10 ng 模板DNA，dd H2O 加至20 μL。

綜上所述，2015—2017年江蘇省如皋市育齡婦女死亡原因中以腫瘤和意外傷害占有率最高，相關部門需針對死亡原因實施針對性干預，加強育齡婦女惡性腫瘤疾病的防治工作，采取各種宣傳渠道、宣傳手段，增強廣大育齡婦女的防癌意識，并積極預防意外傷害的發生，減少育齡婦女死亡率。

PCR 反應程序：95 ℃ 預熱 3 min；95 ℃ 變性 30 s、58 ℃ 退火 30 s、72 ℃ 延伸 45 s，35 個循環；72 ℃延伸 10 min，之后保持10 ℃。

PCR 產物利用2%瓊脂糖電泳進行檢測，合格產物送至上海美吉生物有限公司進行高通量測序。利用Illumina 測序平臺，將得到的PE reads 根據Overlap 關系進行拼接，并對序列進行質量控制。然后進行OTU 聚類分析和物種分類分析，進一步對群落組成進行統計學分析和可視化分析。

1.5 數據分析

腸道菌群數據采用SPSS26 軟件進行統計學分析，采用Kruskal-Wallis 檢驗對門和屬的相對豐度進行比較，采用Benjamini Hochberg 法進行P值校正。生產性能數據采用單因素方差分析，多重比較采用LSD 法。

2 結果與分析

2.1 復方精油對黃羽肉雞生產性能的影響

由表2 可知，復方精油組與空白對照組的合格品出欄率均無顯著差異；復方精油高、低劑量組的平均采食量均極顯著低于空白對照組（P＜0.01），其中復方精油高劑量組的采食量為空白對照組的86.6%；各組之間平均體質量和平均日增重沒有顯著性差異；兩復方精油組的料肉比極顯著高于空白對照組（P＜0.01），飼料轉化率均提高11.4%。

表2 復方精油對黃羽肉雞生產性能的影響Table 2 Effect of compound plant essential oil on production performance of yellow-feathered broilers

2.2 復方精油對黃羽肉雞空腸菌群的影響

黃羽肉雞空腸菌群共檢測到OTU 585 個，分屬于308 種178 屬89 科48 目17 綱11 門1 界。

2.2.1黃羽肉雞空腸樣品物種組成Venn 圖分析結果 由圖1 可知，復方精油高劑量組、低劑量組和空白對照組共有的OTU 數目為154 個，復方精油高劑量組特有的OTU 數目為30 個，復方精油低劑量組特有的OTU 數目為194 個，空白對照組特有的OTU 數目為34 個。復方精油低劑量組的OTU 數量最多，其次為復方精油高劑量組。

圖1 黃羽肉雞空腸樣品物種組成Venn 圖Fig.1 Venn diagram of species composition of jejunum samples of yellow-feathered broilers

2.2.2復方精油對黃羽肉雞空腸菌群α多樣性指數的影響 由表3 可知，各組空腸菌群Coverage指數均大于0.995，即各組樣品檢測覆蓋率均達到99.5%以上，說明檢測結果可信。各組樣品空腸菌群的Sobs 指數、Shannon 指數和 Simpson 指數均沒有顯著性差異，說明各組空腸菌群的多樣性、豐富度、均勻度表現一致。

表3 復方精油對黃羽肉雞空腸菌群α 多樣性指數的影響Table 3 Effect of compound essential oil on α diversity index of jejunum microflora of yellow-feathered broilers

2.2.3黃羽肉雞空腸菌群稀釋曲線分析結果 由黃羽肉雞空腸菌群物種稀釋曲線（圖2）可見，隨著樣本測序深度的增加，表觀實際觀測到的物種豐度在OTU 水平上不斷增加。但所有曲線最終趨于平緩，表示測序深度足夠，數據量合理，實際觀測到的物種數目能夠覆蓋空腸內容物樣品中的菌群物種。

圖2 黃羽肉雞空腸菌群Sobs 指數稀釋曲線Fig.2 Sobs index rarefaction curves of jejunum microflora of yellow-feathered broilers

2.2.4復方精油對黃羽肉雞空腸菌群組成的影響 由表4 可知，黃羽肉雞空腸菌群中相對豐度≥總豐度0.1%的細菌門有9 個。9 個門中占據優勢的是厚壁菌門（相對豐度＞90%）和放線菌門（相對豐度＞1%）。復方精油高、低劑量組疣微菌門的相對豐度均顯著低于空白對照組（P<0.05）。各組間空腸菌群的厚壁菌門與擬桿菌門相對豐度比值（F/B）無顯著性差異。

表4 復方精油對黃羽肉雞空腸菌群組成的影響Table 4 Effect of compound essential oil on the composition of jejunum microflora of yellow-feathered broilers

2.3 復方精油對黃羽肉雞盲腸菌群的影響

黃羽肉雞盲腸共檢測到OTU 917 個，分屬于383 種189 屬84 科45 目20 綱12 門1 界。

2.3.1黃羽肉雞盲腸樣品物種組成Venn 圖分析結果 由圖3 可知，復方精油高劑量組、復方精油低劑量組和空白對照組共有的OTU 數目為671個，復方精油高劑量組特有的OTU 數目最多、為54 個，其次為復方精油低劑量組、為35 個，空白對照組特有的OTU 數目最少、為21 個。

圖3 黃羽肉雞盲腸樣品物種組成Venn 圖Fig.3 Venn diagram of species composition of caecum samples of yellow-feathered broilers

2.3.2復方精油對黃羽肉雞盲腸菌群α多樣性的影響 由表5 可知，各組盲腸菌群Coverage 指數均大于0.995，即各組樣品檢測覆蓋率均達到99.5%以上，說明檢測結果可信。各組Sobs 指數、Shannon 指數和Simpson 指數均無顯著差異，表明復方精油對盲腸菌群的多樣性、豐富度、均勻度沒有影響。

表5 復方精油對黃羽肉雞盲腸菌群α 多樣性的影響Table 5 Effect of compound essential oil on α diversity index of cecum microflora of yellow-feathered broilers

2.3.3黃羽肉雞盲腸菌群稀釋曲線分析結果 由黃羽肉雞盲腸菌群物種稀釋曲線（圖4）可見，隨著樣本測序深度的增加，實際觀測到的物種豐度在OTU 水平上不斷增加。但是所有樣本的稀釋曲線最終趨于平緩，表示測序深度足夠，數據量合理，實際觀測到的物種數目能夠覆蓋盲腸內容物樣品中的菌群物種。

圖4 黃羽肉雞盲腸菌群Sobs 指數稀釋曲線Fig.4 Sobs index rarefaction curves of cecum microflora of yellow-feathered broilers

2.3.4復方精油對黃羽肉雞盲腸菌群組成的影響 黃羽肉雞盲腸菌群中相對豐度≥總豐度1% 的細菌門有8 個（表6）。由表6 可知，黃羽肉雞盲腸優勢菌是厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidota），其次是放線菌門（Actinobacteriota）和藍藻門（Cyanobacteria）。

表6 復方精油對黃羽肉雞盲腸菌群組成的影響Table 6 Effect of compound essential oil on the composition of cecum microflora of yellow-feathered broilers

復方精油低劑量組的彎曲桿菌門（Campilobacterota）和藍藻門（Cyanobacteria）相對豐度顯著高于空白對照組（P<0.05），復方精油高劑量組的變形桿菌門（Proteobacteria）相對豐度顯著高于空白對照組（P<0.05）。復方精油低劑量組的厚壁菌門（Firmicutes）相對豐度顯著高于復方精油高劑量組（P<0.05），擬桿菌門（Bacteroidota）相對豐度顯著低于復方精油高劑量組（P<0.05），且其厚壁菌和擬桿菌相對豐度比值（F/B）顯著高于復方精油高劑量組（P<0.05）。

黃羽肉雞盲腸菌群中相對豐度≥總豐度1%的細菌屬有13 個（表6）。13 個屬中各組優勢屬均為擬桿菌屬（Bacteroides）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、另枝菌屬（Alistipes）、Clostridia UCG-014、Christensenellaceae R-7 屬、糞桿菌屬（Faecalibacterium）以及瘤胃球菌屬（Ruminococcus）。

復方精油高、低劑量組的 Clostridia_vadinBB60_group 和另枝菌屬相對豐度均顯著低于空白對照組（P<0.05），復方精油高劑量組的Clostridia_UCG-014 相對豐度顯著低于空白對照組（P<0.05），復方精油高劑量組擬桿菌屬相對豐度顯著高于空白對照組和復方精油低劑量組（P<0.05），復方精油低劑量組瘤胃球菌屬相對豐度顯著高于空白對照組（P<0.05）。

3 討論

植物精油對肉雞生長性能具有一定的促進作用。魏全意等［15］研究發現，植物精油凈力安能顯著提高肉雞的生產性能，提高機體消化吸收能力和免疫力。黃金昌等［16］研究指出，在雞飲水中添加水溶性植物精油200～ 400 mL/t 能提高白羽肉雞出欄時的體質量，降低死亡率，提高歐洲效益指數。李彬等［17］研究表明，飼料中添加30 mg/kg 復合植物精油能有效改善麻黃肉雞平均日采食量和料重比。這些研究結果與本試驗結果一致，本試驗中肉豆蔻和羅勒復方精油能夠顯著降低黃羽肉雞的料肉比 。

腸道菌群能影響宿主的新陳代謝、生理和免疫系統，維持腸道菌群結構平衡，對機體健康有利［18］。本試驗在日糧中添加肉豆蔻和羅勒復方精油后，肉雞空腸和盲腸仍保持原有的菌群平衡，有益于腸道健康。已有研究表明，植物精油能增加盲腸的OTU 數，提高盲腸中細菌的多樣性［19］。本研究發現，復方精油增加了黃羽肉雞空腸和盲腸的OTU 數，表明復方精油能提高空腸和盲腸的細菌多樣性。

植物精油對腸道菌群具有一定的調節作用。Koutsos 等［20］發現，植物精油能夠降低雞盲腸中大腸桿菌、腸球菌和葡萄球菌的數量，增加腸道內乳酸菌的數量。Seyyed 等［21］認為，日糧中添加600 mg/kg 羅勒精油能顯著降低雞腸道菌群內大腸桿菌的菌落數。Matulyte 等［22］報道，肉豆蔻精油能抑制肉雞腸道內糞腸球菌和多殺性巴氏桿菌的生長。鄭建怡等［23］指出，多種植物精油能改變肉雞腸道內的微生物菌群數量，增加有益細菌數量，減少有害細菌數量。這些研究結果與本試驗結果一致，肉豆蔻和羅勒復方精油能夠提高肉雞腸道菌群中雙歧桿菌的相對豐度，降低梭菌屬的相對豐度。

在空腸腸道菌群研究方面，張伯池等［24］報道，添加600 mg/kg 復合植物提取物可顯著增加肉雞空腸菌群中疣微菌門豐度，表明復合植物提取物有利于腸道內有益細菌的定植，使腸道處于較為健康的狀態。假單胞菌屬和雙歧桿菌屬均屬于雙歧桿菌科［25］。研究發現，雙歧桿菌能夠調節腸道菌群，促進有益菌生長，抑制有害菌生長，提高腸道的抵抗力和免疫力，有助于輕度腸道感染的控制［26］。腸道菌群中，韋榮氏球菌屬的存在與疾病緩解或穩定相關［27］，片球菌屬能夠調節腸道菌群并維持腸道微生態平衡［28］。本研究表明，飼糧中添加肉豆蔻和羅勒復方精油可顯著降低菌群中疣微菌門的相對豐度，顯著提高空腸假單胞菌屬、雙歧桿菌屬、韋榮氏球菌屬和片球菌屬的相對豐度，說明肉豆蔻和羅勒復方精油能夠增加空腸內有益菌的豐度。

在盲腸腸道菌群研究方面，Akram 等［29］報道，擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門是肉雞盲腸的主要菌群，三者相對豐度之和甚至超過90%。胡永飛等［30］報道，雞盲腸菌群中擬桿菌門占優勢。隨著日齡增加，雞盲腸菌群結構逐漸發生變化，厚壁菌門相對豐度逐漸降低，擬桿菌門相對豐度逐漸升高［31］。本試驗黃羽肉雞60 日齡時，占據盲腸菌群優勢地位的是厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門。其中，放線菌門成為盲腸優勢菌是因為該菌門中的雙歧桿菌豐度較高。

值得注意的是，厚壁菌門和擬桿菌門對雞的代謝和免疫有重要意義，其中兩者的相對豐度比值（F/B）是近年來備受關注的熱點。研究表明，F/B 比值與脂肪的沉積呈正相關，高脂食物可提高該比值［32］。馮宇等［33］研究發現，腸道菌群中F/B 比值降低，有助于改善肉雞代謝、減少脂肪沉積。但本試驗中肉豆蔻和羅勒復方精油組的F/B 比值與空白對照組差異不顯著。

據報道，動物腸道菌群中一些厭氧菌屬能產生短鏈脂肪酸，降低腸道內的pH 值，增加腸道內酸度，促進有益菌增殖，改善腸道菌群結構［34］。乳酸菌屬在代謝中可產生多種短鏈脂肪酸，抑制有害菌生長，還可產生多種氨基酸和多種維生素，為動物機體提供額外營養［35］。擬桿菌屬細菌可利用葡萄糖發酵產生乙酸、琥珀酸，降低pH 值，抑制有害菌生長［36］。楊建平等［37］報道，飼糧中添加復合植物精油，瘤胃菌科的Ruminococcaceae UCG-005 屬、厭氧球菌屬的相對豐度顯著降低，unidentified_Ruminococcaceae 的相對豐度顯著升高，說明復合植物精油對瘤胃菌科相關屬細菌有雙向調節作用。同時，研究發現，Clostridia_UCG-014、Clostridia_vadinBB60_group等梭菌屬數量增多會造成動物機體腸道微生態紊亂，并引發腹瀉［38］。另枝菌屬為擬桿菌門中新發現的細菌屬，與腸道炎癥密切相關［39］。本研究發現，肉豆蔻和羅勒復方精油能顯著提高雞盲腸菌群中擬桿菌屬和瘤胃球菌屬相對豐度，顯著降低雞盲腸菌群中Clostridia_vadinBB60_group屬、Clostridia_UCG-014 屬和另枝菌屬的相對豐度，表明添加復方精油能夠增加盲腸菌群中有益菌屬的相對豐度，降低有害菌屬的相對豐度，保持腸道菌群健康狀態。

4 結論

肉豆蔻和羅勒復方精油可顯著降低黃羽肉雞的料肉比，飼料轉化率提高11.4%。飼喂肉豆蔻和羅勒復方精油后，黃羽肉雞空腸和盲腸的優勢菌依然是厚壁菌門、放線菌門、擬桿菌門等，放線菌門中重要的益生菌-雙歧桿菌屬仍為優勢屬。同時，復方精油可顯著提高空腸雙歧桿菌屬、假單胞菌屬、韋榮氏球菌屬和片球菌屬及盲腸擬桿菌屬、乳酸菌屬和瘤胃球菌屬等有益菌的相對豐度，可顯著降低空腸疣微菌門、盲腸有害梭菌屬等的相對豐度。可見，飼喂肉豆蔻和羅勒復方精油能夠促進黃羽肉雞空腸和盲腸的有益菌生長，抑制有害菌增殖，改善腸道菌群，維持菌群平衡，利于腸道健康，明顯提高黃羽肉雞的生產性能。本研究結果為肉豆蔻和羅勒復方精油作為飼料添加劑在肉雞生產中推廣應用提供了有力依據。