紫心甘薯IbMYB1 上游7 個調控蛋白的互作與表達分析

付丹文，陳亞慧，楊少華，高 峰

（1.華南師范大學生命科學學院，廣東 廣州 510631；2.廣東省科學院南繁種業研究所，廣東 廣州 510315）

【研究意義】甘薯〔Ipomoea batatas（L）.Lam.〕是重要的糧食、飼料和工業原料作物。花色素苷具有抗氧化和清除自由基的作用，對肝臟和眼睛具有保護作用，對糖尿病具有一定的治療作用［1］。紫心甘薯的塊根生長于土壤中，處于完全黑暗的環境，內部能大量積累花色素苷，其花色素苷積累部位具有一定的特殊性。目前，對于植物的花、果、莖、葉等地上部分花色素苷合成以及環境信號因子影響的分子機制有了一定認識，尤其是光照對花色素苷合成的調控機制及信號傳導過程已比較清楚［2］。對于非依光型或無法直接接受光照的植物根、塊根或塊莖中花色素苷合成調控機制及信號傳遞過程卻不明了。紫心甘薯具有重要的開發價值，對其進行非依光型及植物地下部分花色素苷合成的調控機制研究，可以豐富和深化植物花色素苷生物合成分子調控的基礎理論，為紫心甘薯高花色素苷品種選育提供新的遺傳標記，為其分子育種篩選出合適的操作元件或改造靶標，還可為提高塊根中色素含量提供新的思路。

【前人研究進展】花色素是類黃酮家族最大的分支，類黃酮是一類以黃烷C6-C3-C6 為骨架的衍生物，是普遍存在的植物次生代謝產物。根據黃烷骨架上烴基和甲氧基的數目和位置，花色素可以分為六類：花葵素、花青素、花翠素、甲基花青素、牽牛花色素和錦葵色素［3］。植物花色素苷是原位合成的，由一系列的酶催化完成。隨后，由谷胱甘肽-S-轉移酶將花色素苷由細胞質轉移至液泡，并儲藏于液泡中［3］。在植物體內，特定花色素苷是否合成、合成多少及合成部位主要是由其合成途徑中多個結構基因的表達水平決定，而表達水平受轉錄因子的調控［4］。參與植物花色素苷合成酶基因表達調控的轉錄因子主要有三類：MYB、bHLH（也稱MYC）和WD40。其中，R2R3-MYB 型轉錄因子直接與花色素苷生物合成酶基因的啟動子區域結合，從而激活其轉錄表達。R2R3-MYB 參與植物花色素苷生物合成已有較多報道，如R2R3-MYB 轉錄因子GhMYB1a參與調控非洲菊花青素和黃酮醇積累［5］；茄子中R2R3-MYB 轉錄因子SmMYB75受光誘導，在花瓣中特異性表達，調控茄子花青素的積累［6］；毛白楊中R2R3-MYB 轉錄因子MYB6，主要在幼葉中表達，MYB6的過表達上調類黃酮生物合成基因的表達，導致花青素和原花青素的積累顯著增加［7］；R2R3-MYB 轉錄因子MdMYB114促進蘋果果皮中花色素苷的積累［8］；葡萄紫色葉和莖中，2 號染色體上的VvMYBA1表達上調，14號染色體上VvMYBA5、VvMYBA6和VvMYBA7調控葡萄營養組織花色素苷的積累，1 組R2R3-MYB 負調控葡萄營養組織花色素苷的積累［9］，LMMYB參與番茄果實顏色的形成［10］，CsMYB4-5、CsMYB4-6 和CsMYB4-7 參與調控茶樹樹葉花青素積累［11］。

【本研究切入點】已有研究表明，紫心甘薯中R2R3-MYB 轉錄因子IbMYB1通過與花色素苷合成途徑酶基因啟動子的直接結合激活其表達，從而促進花色素苷的合成［12］。IbMYB1基因在轉基因黃肉甘薯中超表達，導致一系列花色素苷合成酶基因表達上調，花色素苷含量增加，出現黃中帶紫的“雙色”薯肉，抗氧化性顯著提高［13］。IbMYB1基因的上游轉錄調控因子的調控機制目前尚不明確。本研究前期利用已克隆的IbMYB1啟動子序列，分別進行酵母單雜交文庫篩選，以篩選其上游轉錄調控因子，并對篩選出的上游轉錄調控因子與靶基因關系、亞細胞定位、自激活活性以及它們之間的相互作用進行研究，篩選得到的7 個IbMYB1上游轉錄調控因子分別為IbERF1、IbPDC、IbPGP19、IbSCF、IbWRKY1、IbJOX4 和IbEIN3-2。【擬解決的關鍵問題】 本研究對7 個IbMYB1上游調控蛋白的互作與表達進行分析，進一步闡明花色素苷在特定時空合成與積累的調控網絡。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為紫心甘薯品系‘A5’和白心甘薯‘禺北白’，采自華南師范大學生物園。野生型擬南芥（Arabidopsis thaliana）種子保存于華南師范大學生命科學學院實驗室。載體pCambia1300由華南師范大學生命科學學院高彩吉老師提供；載 體pSAT4-nEYP-C1 和pSAT4-cEYP-C1 由 華南師范大學生命科學學院王亞琴老師提供；載體pGADT7 和pGBKT7 由華南師范大學生命科學學院實驗室保存。

1.2 試驗方法

1.2.1植物總RNA 提取、純度鑒定及反轉錄 使用植物總RNA 小提試劑盒（Magen），進行紫心甘薯塊根RNA 的提取，具體方法參照試劑盒操作步驟。從所得RNA 溶液中吸取2 μL 總RNA，使用Nano Drop ND1000 微量測定分光光度計測定RNA 濃度并進行純度鑒定，測定結果為OD260/OD280＜2.0，OD260/OD280＞2.0，可用于反轉錄試驗，同時吸取5 μL 總RNA 進行瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度。紫外檢測能看到兩條清晰可區分的主帶（28S 和18S）的RNA，表明RNA 無降解，用于后續反轉錄試驗。按照Takara 說明書合成cDNA 第一鏈，-20 ℃保存備用。

1.2.2目的片段與表達載體的連接 以紫心甘薯塊根cDNA 為模板，用TaKaRa 高保真酶PrimeSTAR?Max DNA Polymerase 擴增兩端帶有不同酶切位點末端的目的片段序列，PCR 產物使用瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒（Magen）純化回收，具體方法參照試劑盒操作步驟。使用TaKaRa 限制性內切酶對質粒進行雙酶切，反應條件為37 ℃，連接30 min。經電泳檢測正確的酶切產物進行切膠回收。使用Clon Express II One Step Cloning Kit試劑盒（Vazyme）將目的片段和表達載體進行連接，反應條件為37 ℃，連接30 min。連接產物轉化DH5α 感受態細胞。取陽性菌落進行菌落PCR檢測，取擴增得到與目的片段大小一致的陽性菌種的菌液200 μL，送至上海生工生物有限公司進行測序。測序正確的菌液中加入20%的滅菌甘油于1.5 mL 離心管，-80 ℃冰箱保存。

1.2.3pGBKT-7-上游調控因子載體的毒性檢測 將前期篩選得到的7 個IbMYB1上游調控因子（IbERF1、IbPGP19、IbPDC、IbEIN3-2、IbJOX4、IbSCF 和IbWRKY1），分別構建pGBKT-7-上游調控因子酵母重組表達載體，將重組載體與空載體pGBKT-7 分別轉到酵母Y2HGold 細胞，將轉化的酵母菌液均勻涂布在SD/-Trp 培養基，觀察重組表達載體與空載體酵母菌株生長情況，進行毒性檢測。選擇載體中EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ作為目的片段插入的酶切位點，合成引物序列。LB 固體培養基含Kan 抗性，使用Magen 質粒小量提取試劑盒提取構建好的酵母重組表達載體質粒，-20℃保存。

1.2.4pGBKT-7-IbERF1菌株最低AbA濃度的確定自激活試驗結果顯示，pGBKT-7-IbERF1菌株具有自激活活性，需確定抑制其自激活活性的最低金擔子素A（AbA）濃度。從Y2H［pAGBKT-7-IbERF1］、陽性對照和陰性對照的培養皿中挑取較大的單克隆菌落，將0.9 % NaCl 重懸溶液稀釋成10-1、10-2和10-3濃度梯度。吸取10 μL 重懸菌液于相應缺素培養基和添加不同濃度AbA 的缺素培養基上培養。若在某濃度下菌落Y2H［pAGBKT-7-IbERF1］和陰性對照不生長，而陽性對照正常生長，則該濃度為該酵母菌株的最低AbA 濃度，可用于后續試驗。

1.2.5酵母雙雜交載體的構建與Y2HGold 酵母轉化 使用酵母雙雜交的方法，研究7 個IbMYB1上游調控因子的相互作用。構建酵母雙雜交試驗所需的載體，通過轉化酵母Y2H 驗證蛋白與蛋白之間的相互作用，將IbERF1構建到pGADT-7 載體中，將IbPGP19、IbPDC、IbEIN3-2、IbJOX4、IbSCF和IbWRKY1構建到pGBKT-7 載體中。LB 固體培養基含Kan 抗性，使用Magen 質粒小量提取試劑盒提取構建好的酵母重組表達載體質粒，-20 ℃保存。

酵母轉化參照Yeastmaker Yeast Transformation System 2 進行，取5 μL Yeastmaker Carrier DNA 于95 ℃水浴5 min 使其變性，快速置于冰上至溫度降至4 ℃（重復1 次）。在已預冷的1.5 mL 離心管中依次加入500 μL PEG/LiAc（50 μL TE、50 μL LiAc、400 μL PEG4000）、5 μL 變性的Yeastmaker Carrier DNA、100 ng 重組融合表達質粒、50 μL Y2HGold 感受態細胞，渦旋混勻，置于30 ℃恒溫培養箱中孵化30 min（期間每隔10 min 輕輕倒混數次）。加入20 μL DMSO，輕混勻，置于42 ℃水浴中15 min（期間每隔5 min 輕輕倒混數次）。12 000 r/min 離心30 s，棄上清，加入0.9% NaCl 溶液1 mL，重懸菌體。吸取200 μL 轉化后的酵母菌液，涂布于SD/-Trp 培養皿。30 ℃培養箱中倒置培養48～96 h。從缺陷培養基SD/-Trp 培養皿上挑取陽性克隆，轉移到含AbA 的缺陷培養基SD/-His/AbA，觀察其生長情況。再從缺陷培養基SD/-His/AbA 挑取陽性克隆，轉移到缺陷培養基SD/-His/AbA/X-a-Gal plus，30 ℃避光條件培養2～3 d，觀察酵母生長情況，拍照記錄。

1.2.6雙分子熒光互補載體的構建 將IbERF1構建到pSAT4-nEYFP-C1 載體中，將IbSCF和IbWRKY1構建到pSAT4-cEYFP-C1 載體中。將重組質粒轉化擬南芥原生質體瞬時表達蛋白，在共聚焦顯微鏡下觀察檢測GFP 信號并拍照，在活細胞內驗證蛋白與蛋白之間的相互作用，選擇pSAT4-nEYFP-C1 和pSAT4-cEYFP-C1 載體中作為目的片段插入的酶切位點為BglII 和BamH I，合成引物序列。LB固體培養基含Amp 抗性，使用Magen 質粒小量提取試劑盒提取質粒，-20 ℃保存備用。

1.2.7擬南芥原生質體的制備與轉化 擬南芥原生質體的制備：將配制好的酶解液于55 ℃水浴鍋中預熱，4 周后選擇抽苔前的野生型擬南芥葉片，將葉片下表皮撕掉迅速置于酶解液中。25 ℃、50 r/min 避光輕微振動酶解50 min，至葉肉細胞酶解完全，顯微鏡下觀察原生質體形態，當細胞較圓、透亮時狀態較好。

用等體積的W5 稀釋酶液，輕輕混勻，然后將洗干凈的75 μm 尼龍網布用W5 浸濕后過濾原生質體。800 r/min 離心2 min，盡量吸去上清，用1 mL W5 溶液重懸原生質體（3 次重復）。將原生質體重懸于1 mL W5 溶液中，冰上放置30 min，備用。

擬南芥原生質體的轉化：2 mL EP 管中加入10～20 μg 目的質粒，加入100 μL 擬南芥原生質體，輕輕混勻后立即放置冰上。加入110 μL PEG/CaCl2，輕彈離心管使之混勻，室溫孵育10 min。加入220 μL W5 溶液，顛倒離心管使其混勻，放置1 min。再向離心管加入440 μL W5 溶液，輕輕顛倒，放置1 min。最后向離心管加入880 μL W5溶液，顛倒混勻，放置1 min。4 ℃ 800 r/min 離心3 min，吸去上清。原生質體用500 μL W5 溶液重懸，22 ℃黑暗條件培養16～20 h。

2 結果與分析

2.1 pGBKT-7-上游調控因子載體的毒性檢測

pGBKT-7-上游調控因子毒性檢測，觀察pGBKT-7-上游調控因子載體與空載在SD/-Trp培養基上單克隆菌落的生長情況，結果顯示，試驗組和對照單克隆菌落在數量和大小上無明顯差異（圖1），說明pGBKT-7-上游調控因子載體對酵母沒有毒性。

2.2 最低AbA 濃度的確定

將已檢測的具有自激活活性的上游調控因子單克隆陽性菌體置于10 μL 0.9% NaCl 溶液重懸菌液，將重懸容液稀釋為10-1、10-2和10-3濃度梯度，點在SD/-Trp 和SD/-Trp/AbA（100～1 000 ng/mL）培養基培養。結果顯示，pGBKT7-IbERF1自激活AbA 最低抑制濃度為600 ng/mL。

2.3 酵母雙雜交檢測IbMYB1 上游調控因子之間的相互作用

將具有自激活活性的IbERF1與pGADT-7 連接構建重組載體，其余上游調控因子與pGBKT-7連接構建重組載體，進行酵母雙雜交試驗檢測其相互作用，結果顯示，IbERF1 與IbSCF、IbWRKY1 存在相互作用（圖2），IbERF1 與IbPDC、IbPGP19、IbJOX4 和IbEIN3-2 不存在相互作用。

圖2 酵母雙雜交檢測 IbMYB1 啟動子上游調控因子的相互作用Fig.2 Interaction detection among upstream transcription factors on the promoter of IbMYB1 by yeast two-hybrid assay

2.4 雙分子熒光互補試驗檢測IbMYB1 上游調控因子之間的相互作用

用雙分子熒光互補試驗對酵母雙雜交檢測結果進行驗證，檢測上述蛋白在植物細胞中是否存在相互作用。將IbERF1與EYFP 蛋白N 端融合，IbSCF和IbWRKY1與EYFP 蛋白C 端融合，然后將帶EYFP 蛋白N 端的融合質粒和帶EYFP 蛋白C 端的融合質粒轉化到擬南芥原生質體中進行表達，若兩個蛋白有相互作用，則EYFP 蛋白N 端和C 端靠近形成完整的蛋白，能檢測到熒光信號。

由圖3 可知，GFP 熒光蛋白在擬南芥原生質體里呈現組成型表達，在整個原生質體中均有表達，IbERF1-nYFP+cYFP 和nYFP+IbSCF/IbWRKY1-cYFP 分別轉到擬南芥原生質體中都未檢測到熒光信號，說明這3 個蛋白與空載并沒有相互作用，而共轉到擬南芥原生質體后能夠檢測到明顯的熒光信號，且熒光信號均在細胞核內，說明IbERF1蛋白與IbSCF 和IbWRKY1 蛋白在細胞核中可發生相互作用，兩者形成復合物共同調控基因的表達。

圖3 雙分子熒光互補試驗檢測IbERF1 與其他上游調控因子在擬南芥原生質體的相互作用Fig.3 Interaction detection among IbERF1 and other upstream transcription factors by BiFC experiment in Arabidopsis thaliana protoplast

2.5 IbMYB1 上游調控因子表達分析

從圖4 可以看出，不同發育時期紫心甘薯柴根、膨大根和塊根中轉錄因子的表達量均高于白心甘薯根，說明花色素苷的合成需要這些轉錄因子的大量表達。IbERF1基因在紫心甘薯根不同時期的表達量均低于白心甘薯，且隨著根中花色素苷的積累其表達量逐漸減低，推測IbERF1可能負調控花色素苷的合成。IbWRKY1與IbSCF基因在紫心甘薯和白心甘薯根不同發育時期中的表達量與花色素苷的積累沒有呈現單一的正相關或者負相關，推測這些基因參與紫心甘薯花色素苷的合成與調控可能還存在更為復雜的機制。

圖4 紫心甘薯與白心甘薯不同根系階段花色素苷合成調控基因的相對表達量Fig.4 Relative expression levels of anthocyanin synthesis regulatory genes in purple-fleshed and white-fleshed sweet potato at different root stages

3 討論

花色素是目前發現最有效的天然抗氧化物質［1］，近年來廣泛受到人們的青睞。紫心甘薯中調控花色素苷合成的關鍵轉錄因子IbMYB1上游轉錄調控因子之間存在的互作關系鮮有報道。本研究采用酵母雙雜交試驗，對7 個IbMYB1上游調控因子（IbERF1、IbPDC、IbPGP19、IbSCF、IbWRKY1、IbJOX4 和IbEIN3-2）之間的相互作用進行檢測。結果顯示，IbERF1 與IbSCF、IbWRKY1 存在相互作用，雙分子熒光互補試驗證實了酵母雙雜交的試驗結果。

乙烯響應因子ERF 家族蛋白屬于已知最大的轉錄因子家族，參與多個生理過程［14］。在植物中，轉錄因子ERF 參與花色素苷生物合成的調控。比較紫心甘薯和白心甘薯的轉錄組數據顯示，花色苷合成結構基因受轉錄因子在轉錄水平上調控，參與調控的轉錄因子有MYB、bHLH、ERF 和WRKY［15］。比較紫花和白花的轉錄組和代謝組數據可知，在紫色花中分別檢測到MYB、bHLH、AP2/ERF、WD40、WRKY 和Zinc-finger轉錄因子14、9、1、33、4、12 個，其中上調的轉錄因子數量分別為10、6、0、30、4、10 個［16］。轉錄因子ERF 與MYB 存在相互作用，轉錄因子ERF 既可以與轉錄因子MYB 蛋白結合調控花色素苷合成相關基因的表達，也可與MYB基因啟動子結合調控其表達。在蘋果的愈傷組織中過表達MdERF1B，乙烯合成途徑中的相關基因MdACO1、MdERF1和MdERF3與花色素苷合成與調控相關的基因MdCHS、MdCHI、MdF3H、MdDFR、MdANS、MdLAR、MdANR、MdMYB9和MdMYB11均顯著上調，花色素苷和原花色素苷含量也明顯上升。通過酵母雙雜交、雙分子熒光互補和pull-down 試驗結果顯示，MdERF1B與MdMYB9、MdMYB1 和MdMYB11 蛋白存在相互作用。酵母單雜交和EMSA 試驗結果顯示，MdERF1B 與MdMYB9、MdMYB1和MdMYB11的啟動子具有相互作用。在LUC 試驗中，MdERF1B主要通過激活MdMYB9和MdMYB11啟動子的活性來調控其基因表達［17］。在紅皮梨中，PpERF24和PpERF96 與PpMYB114 調節藍光誘導的花色素苷合成，PpERF24 和PpERF96 加強PpMYB114 和PpbHLH3 蛋白的相互作用，也加強PpMYB114 誘導的結構基因的表達［18］。在紅皮梨中，PpERF3與PpMYB114、PpbHLH3 形成轉錄復合物調控紅皮梨中花色素苷的合成［19］。WRKY基因家族是高等植物轉錄因子家族中一個大家族，在植物生理過程和環境適應的轉錄調節中起重要作用［20］。在甘薯中，WRKY 蛋白（SPF1）的cDNA 序列被首次克隆［21］。有報道發現，WRKY 參與花色素苷合成的調控，如WRKY40 參與蘋果中花色素苷合成的調控［22］。SCF 蛋白（GID2）復合物介導了DELLA 蛋白（GAI、RGA 和RGL2）的泛素化和降解。本研究結果顯示，IbERF1 與IbSCF 和IbWRKY1 相互作用參與紫心甘薯中參與花色素苷合成的關鍵轉錄因子IbMYB1表達，為提高甘薯花色素苷含量的分子定向育種提供新的操作元件和研究思路。

4 結論

酵母雙雜交與雙分子熒光互補試驗發現，紫心甘薯IbMYB1上游7 個調控蛋白中，IbERF1 與IbSCF、IbWRKY1 存在相互作用。定量檢測結果顯示，IbERF1基因在紫心甘薯根不同時期的表達量均低于白心甘薯，且隨著根中花色素苷的積累其表達量逐漸降低，推測IbERF1可能負調控花色素苷的合成。IbWRKY1和IbSCF基因在紫心甘薯和白心甘薯根不同發育時期中的表達量，與花色素苷的積累未呈現明顯的正相關或者負相關關系，推測這些基因參與紫心甘薯花色素苷的合成與調控可能還存在更為復雜的機制。本研究結果為進一步深入闡釋紫心甘薯塊根及地下部分特異性合成與積累花色素苷的調控機理奠定基礎。