懷玉山產三葉青葉綠體基因組特征及其系統進化關系

洪森榮，劉雯莉，宋冰雁，顏玉情

懷玉山產三葉青葉綠體基因組特征及其系統進化關系

洪森榮1, 2, 3, 4，劉雯莉1，宋冰雁1，顏玉情1

1. 上饒師范學院生命科學學院，江西 上饒 334001 2.上饒農業技術創新研究院，江西 上饒 334001 3.上饒市藥食同源植物資源保護與利用重點實驗室，江西 上饒 334001 4.上饒市三葉青保育與利用技術創新中心，江西 上饒 334001

解析懷玉山產三葉青葉綠體基因組信息序列特征和確定其在崖爬藤屬的系統位置。用Illumina高通量測序平臺NovaSeq6000進行測序獲得懷玉山產三葉青葉綠體基因組序列，借助GeSeq、tRNAscan-SE、MISA、VISTA tools、DNADnaSP6.0、JSHYCloud、CodonW1.4.2、Pasteur Galaxy、mafft 7.0、fasttree 2.1.10等生物信息學工具進行序列分析、密碼子偏好分析、崖爬藤屬基因組比較分析和系統發育研究。懷玉山產三葉青葉綠體基因組為共價閉合雙鏈環狀分子，長160 165 bp，包含1個大單拷貝區（large single copy region，LSC）、1個反向重復區a（inverted repeat region a，IRa）、1個反向重復區b（inverted repeat region b，IRb）和1個小單拷貝區（small single copy region，SSC）；懷玉山產三葉青葉綠體基因組注釋到光合作用基因、自我復制基因、其他基因和未知功能基因4類共133個基因，包括 88個CDS基因、37個tRNA基因和8個rRNA基因；懷玉山產三葉青葉綠體基因組檢測到63個SSR位點，其中單堿基重復56個，雙堿基重復7個；懷玉山產三葉青葉綠體基因組核苷酸多樣性的變化范圍為0～0.234 18，基因間隔區、以及基因變異率最高。懷玉山產三葉青葉綠體基因組密碼子偏好以A或U結尾，具有較強的偏好性。突變對密碼子偏好性的影響較強，而其他因素如自然選擇對密碼子的偏好性影響較小。懷玉山產三葉青葉綠體基因組有31個高頻密碼子，16個以U結尾，13個以A結尾，2個以G結尾，其中13個為最優密碼子。懷玉山產三葉青與福建產三葉青（MW375708）和廣西產三葉青（MW375709）親緣關系較近，與浙江產三葉青（MT827073）、浙江產三葉青（MW375707）、浙江產三葉青KT033563（NC_029339）、四川產三葉青（MW375710）和浙江產三葉青（MW375711）親緣關系較遠。三葉青之間的親緣關系與地理位置相關性不大。首次采用生物信息學分析方法對懷玉山產三葉青葉綠體基因組進行了全面、深度解析，結果將為崖爬藤屬藥用植物的遺傳多樣性分析以及新品系的遺傳育種研究等提供理論依據。

三葉青；葉綠體基因組特征；系統進化關系；大單拷貝區；小單拷貝區

三葉青Diels et Gilg為我國特有珍稀瀕危葡萄科崖爬藤屬藥用植物[1]，其新鮮或干燥塊根可清熱解毒、消腫止痛、化痰散結，常用于治療小兒高熱驚風、百日咳、毒蛇咬傷等[2]；其干燥全草也可清熱解毒、消腫止痛、活血祛風，常用于治療流行性感冒、肝炎、泌尿系統結石、跌打損傷等[3]。

葉綠體是為綠色植物提供能量的光合細胞器，在光合作用及相關代謝活動中起重要作用[4]。隨著生物技術的開發和應用，葉綠體基因組大小已經確定，被子植物中典型的葉綠體基因組為雙鏈共價閉合環狀分子，具有典型的四分體結構，包括一個大單拷貝區（large single copy region，LSC），小單拷貝區（small single copy region，SSC），反向重復區 a（inverted repeat region a，IRa），反向重復區 b（inverted repeat region b，IRb），植物葉綠體基因組的大小差異由IRa和IRb決定）[5]。被子植物的葉綠體基因組的長度一般在120～170 kb，通常編碼110～130個基因，約40個基因是參與光合作用、轉錄和翻譯[6]。葉綠體基因結構高度保守，確保在進化群體之間基因的直接同源性，能自我復制，多為母系遺傳，進化不重組，直接反映植物進化積累的遺傳變異，可為高等植物群體遺傳學、系統發育和基因組進化提供依據[7]。

三葉崖爬藤植物在形態上很難區分，被認為是崖爬藤屬中最難分類的一個屬，許多專家學者從DNA分子標記和形態學角度對三葉崖爬藤植物進行了相關的研究，但這些分類系統還是存在較大差異，究其原因，一是形態學的傳統物種分類方法易受環境因子影響，二是DNA分子標記關注的側重點存在差異[8]。植物葉綠體基因組遠小于核基因組，編碼區和非編碼區的分子進化速度差異顯著，各類群葉綠體基因組之間共線性良好，隨著系統發育學和基因組學的交融，在植物系統發育研究中，基于葉綠體基因組的系統發育基因組學研究優勢漸漸凸顯，為一些分類困難類群的系統學問題提供了新的解決方案[9-10]。

國內已經有浙江三葉崖爬藤[9-10]葉綠體基因組的相關報道，但未涉及到崖爬藤屬植物葉綠體基因組密碼子偏好性分析。三葉青種質遺傳多樣性十分豐富，浙江產三葉青種質之間的遺傳信息有一定差異[11]。懷玉山產三葉青為江西省上饒市玉山全縣特產，2016年3月31日原中華人民共和國農業部正式批準對“懷玉山產三葉青”實施農產品地理標志登記保護[12]。本研究對懷玉山產三葉青葉綠體基因組進行測序，對其GC含量、SSR位點等進行分析，并與不同產地三葉崖爬藤以及崖爬藤屬其他物種的基因組進行多重比較，以期為懷玉山產三葉青的系統發育和不同產地三葉青的親緣關系提供數據支撐，同時豐富三葉崖爬藤的葉綠體基因組數據庫，為懷玉山產三葉青的遺傳多樣性保護、生產性狀等相關研究提供理論基礎，也為懷玉山產三葉青種質鑒定、DNA條形碼開發提供新思路。

1 材料與儀器

1.1 材料

懷玉山產三葉青栽培種“懷玉2號”試管苗（由上饒市三葉青保育與利用技術創新中心提供）。由上饒市紅日農業開發有限公司陳榮華高級農藝師鑒定為三葉青Diels et Gilg栽培種“懷玉2號”試管苗。

1.2 儀器

高通量二代測序NextSeq 550AR基因測序儀（Illumina公司，美國）。

2 方法

2.1 DNA提取和測序

用CTAB法提取懷玉山產三葉青葉片DNA，DNA濃度利用Qubit2.0進行精確定量檢測合格后，將DNA片段化（Covaris超聲波破碎儀隨機打斷），經過片段純化、末端修復等途徑獲得測序文庫。文庫構建完成后，先用Qubit2.0進行初步定量，稀釋文庫，隨后使用Agilent 2100對文庫的插入片段進行檢測，插入片段大小符合預期后，使用Q-PCR方法對文庫的有效濃度進行準確定量，以保證文庫質量。文庫檢測合格后，在天津諾禾致源科技有限公司用Illumina高通量測序平臺NovaSeq6000進行測序。

2.2 基因的組裝和注釋

首先利用SOAPnovo v2.04（http://soap. genomics.org.cn/）拼接軟件對質控后的全部clean data進行novo初步組裝，將組裝得到的全部contig與葉綠體數據庫進行比對，篩選得到來自葉綠體的contig；然后利用MITObim v1.6通過迭代比對，將測序的所有clean reads mapping到這些contig上進行延伸，通過gap close獲得葉綠體的全基因組序列。將懷玉山產三葉青葉綠體基因組序列上傳至NCBI（GenBank登錄號OP589402）。使用GeSeq、tRNAscan-SE對葉綠體基因組進行注釋，再經過手工校正后得到最終的葉綠體基因組基因注釋結果。使用OGDRAW制作葉綠體基因組圖譜。

2.3 葉綠體基因組特征分析

使用MISA在線工具（https://webblast.ipk- gatersleben. de/misa /index. php）的微衛星定位檢測技術對懷玉山產三葉青葉綠體基因組序列中的簡單重復序列（Simple sequence repeats，SSR）進行搜索。用VISTA tools繪制結構mVIST結構變異圖。利用DNADnaSP6.0軟件計算近緣物種的基因組Pi。通過JSHYCloud在線工具集分析懷玉山產三葉青葉綠體基因組IR 區邊界結構差異，從NCBI中選崖爬藤屬浙江產三葉青Diels et Gilg、扁擔藤(Hook.) Gagnep.、毛五葉崖爬藤Pierre ex Gagnep.、Linnaeus、(Miq.) Planch.；葡萄翁屬祖提葡萄翁(Dinter & Gilg) Desc.、矮葡萄甕(N. E. Br.) Desc. ex Wild & R. B. Drumm.、(Sprague) Desc.、桑德森葡萄翁Linnaeus和烏蘞莓烏蘞莓(Thunb.) Raf.的10種植物葉綠體基因組來比對不同物種間葉綠體基因組異同。運用軟件CodonW1.4.2分析懷玉山產三葉青葉綠體基因組的相對同義密碼子使用情況（relative synonymous condon usage，RSC）。通過Pasteur Galaxy 在線工具集（https://galaxy.pasteur. fr/ CodonW）中的CodonW模塊分析密碼子使用情況，設置輸出結果為有效密碼子數（ENC）和相對同義密碼子使用度（RSCU），其他參數設為默認值。ENC＞35表示含有較多種類的稀有密碼子，且基因表達量偏低；某一密碼子的RSCU＞1.00表示編碼對應的蛋白質時偏好使用該密碼子，RSCU＜1.00表示不偏好使用該密碼子，RSCU＝1.00表示該密碼子沒有偏好性。對近緣物種進行GC3～GC12分析（Neutrality-plot分析）、ENC-plot分析和PR2-bias-plot分析和最優密碼子分析。將懷玉山產三葉青葉綠體基因組序列上傳至NCBI進行BLASTn比對，選擇highly similar sequence（megablast）來比較相似性在95%以上的序列，檢索獲得懷玉山產三葉青的近緣種，以明確懷玉山產三葉青葉綠體基因組序列在葡萄科中的系統關系。序列比對利用mafft 7.0軟件，建樹利用fasttree 2.1.10軟件。

3 結果與分析

3.1 懷玉山產三葉青葉綠體基因組的結構特征

測序raw reads為17 808 860條。測序clean reads為17 695 827條。經組裝和注釋后懷玉山產三葉青葉綠體基因組為共價閉合的雙鏈環狀分子（圖1），長160 165 bp，具有典型的四分體結構，由1個LSC、2個IR（1個IRa和1個IRb）和1個SSC共4部分組成，其中，LSC、SSC、IRa和IRb區的長度分別為88 172、18 963、26 515和26 515 bp。基因組的總GC含量為37.50%，其中，LSC、SSC、IRa和IRb區的GC含量分別為35.50%、31.76%、42.89%和42.89%。

3.2 懷玉山產三葉青葉綠體基因類型分析

對懷玉山產三葉青葉綠體基因組進行在線注釋，結果見表1。由表1可知，共注釋到光合作用基因、自我復制基因、其他基因和未知功能基因4類，包括88個CDS基因、37個tRNA基因和8個rRNA基因，共133個基因。對有多個外顯子的葉綠體基因進行結構分析，由2個外顯子構成的基因有19個，包括8個CDS基因和13個tRNA基因，其中有2個基因在IR區重復；由4個外顯子構成的基因有4個，均為4個tRNA基因；完全在LSC區的基因有82個；完全在SSC區的基因有12個；完全在IRb和IRa區的基因有17個；在SSC-IRb junction的基因有1個；在LSC-IRb junction的基因有1個；在SSC-IRa junction的基因有1個；在LSC-IRa junction無基因；rps12有2個拷貝，每個拷貝具有3個外顯子，且2個拷貝共享第一個外顯子，第一個外顯子位于LSC區域，另外2個外顯子位于IR區域。

圖1 懷玉山產三葉青葉綠體基因組圖譜

表1 懷玉山產三葉青葉綠體基因功能分類

Fig.1 Chloroplast gene functional classification offrom Huaiyu Mountain

基因功能基因類型基因名基因數量 光合作用光系統psaA、psaB、psaC、psaI、psaJ 5 光系統ⅡpsaJ、psbA、psbB、psbC、psbD、psbE、psbF、psbH、psbI、psbK、psbL、psbM、psbT、psbZ14 NADH 脫氫酶ndhA、ndhB、ndhB、ndhC、ndhD、ndhE、ndhF、ndhG、ndhH、ndhI、ndhJ、ndhK12 細胞色素b /f 復合體petA、petB、petD、petG、petL、petN 6 ATP合成酶atpA、atpB、atpE、atpF、atpH、atpI 6 自我復制核糖體大亞基蛋白質rpl14、rpl16、rpl2、rpl2、rpl20、rpl22、rpl23、rpl23、rpl32、rpl33、rpl3611 核糖體小亞基蛋白質rps11、rps12、rps12、rps14、rps15、rps16、rps18、rps19、rps2、rps3、rps4、rps7、rps7、rps814 核糖體大亞基rbcL 1 RNA聚合酶rpoA、rpoB、rpoC1、rpoC2 4 核糖體RNArrn16、rrn16、rrn23、rrn23、rrn4.5、rrn4.5、rrn5、rrn5 8 轉運RNA trnC-GCA、trnD-GUC、trnF-GAA、trnG-GCC、trnH-GUG、trnI-CAU、trnI-CAU、trnK-UUU trnTERM-UUA、trnL-CAA、trnL-CAA、trnL-UAA、trnL-UAG、trnM-CAU、trnN-GUU、trnN-GUU、trnP-UGG、trnQ-UUG、trnR-ACG、trnR-ACG、trnR-UCU、trnS-GCU、trnS-GGA、trnS-UGA、trnT-UGU、trnV-GAC、trnV-GAC、trnV-UAC、trnW-CCA、trnY-GUA、trnfM-CAU30 其他基因成熟酶matK 1 蛋白酶clpP1 1 囊膜蛋白cemA 1 乙酰輔酶A羧化酶accD 1 C-型細胞色素合成基因ccsA 1 翻譯起始因子infA 1 未知功能基因保守假設葉綠體閱讀框架ycf1、ycf1、ycf15、ycf15、ycf2、ycf2 6

3.3 懷玉山產三葉青葉綠體基因重復序列分析

懷玉山產三葉青葉綠體基因組中SSR的類型及分布見表2。由表2可知，在懷玉山產三葉青葉綠體基因組中共檢測到63個SSR位點，其中，單堿基重復有56個，雙堿基重復有7個，其中，重復單元為A、重復頻率為10的SSR位點數量最多（7），重復單元為T、重復頻率為10的SSR位點數量最多（11），重復單元為A/T的最高重復頻率為18。

3.4 懷玉山產三葉青IR區邊界結構差異分析

懷玉山產三葉青IR區邊界結構差異分析見圖2。由圖2可知，11種葡萄科植物葉綠體基因組結構從LSC中間呈線性展開，均由1個LSC區、1個SSC和2個反向重復區（IRa和IRb）4部分組成，各個區域間對應的連接基因相同。除了的基因位于接近JLB邊界的LSC區外，其他10種植物浙江產三葉青、扁擔藤、毛五葉崖爬藤、、烏蘞莓、祖提葡萄翁、矮葡萄甕、、桑德森葡萄翁的基因橫跨 JLB邊界；基因位于接近JLB邊界的LSC區；基因位于接近JLB邊界的IRb區和接近JLA邊界的IRa區；基因橫跨JSB邊界和JSA邊界；除了烏蘞莓和的基因橫跨JSB邊界外，其他9種植物浙江產三葉青、扁擔藤、毛五葉崖爬藤、、、祖提葡萄翁、矮葡萄翁、桑德森葡萄翁的基因位于接近JSB邊界的SSC區；基因和基因位于接近JLA邊界的LSC區。由IR區邊界擴張和收縮情況看，葡萄科植物、、和4個基因位置和長度在屬間差異明顯，基因位置和長度不太一致。懷玉山產三葉青和浙江產三葉青基因和基因一致，但具有位置和長度的特異性，與烏蘞莓屬和葡萄翁屬組間差異明顯，說明基因和基因不同程度的擴張和伸縮導致了不同物種間的IR和SSC區長度差異。

表2 懷玉山產三葉青葉綠體基因組中SSR的類型及分布

Table 2 Type and distribution of SSR in chloroplast genome of T. hemsleyanum from Huaiyu Mountain

重復單元堿基類型重復單元重復次數總數 5678910111213141516171819 A????? 7 5 522?2???23 C????? 1????????? 1 T?????11 8 543????132 AT??11? 2????????? 4 CT??1???????????? 1 TA?11???????????? 2 A/T?????18131065?2??155 C/G????? 1????????? 1 AG/CT??1???????????? 1 AT/AT?121 2????????? 6

JLB-LSC和IRb區的邊界 JSB-IRb和SSC區的邊界 JSA-SSC和IRa區的邊界 JLA-IRa和LSC區的邊界

3.5 葉綠體基因組比對分析

以懷玉山產三葉青為參考，使用mVISTA在線軟件對11種葡萄科植物葉綠體基因組進行全序列比對，以分析11種葡萄科植物葉綠體基因組序列的差異。結果表明，崖爬藤屬、烏蘞莓屬、葡萄翁屬植物的基因組變化較大，但崖爬藤屬植物的基因組較為保守，特別是懷玉山產三葉青和浙江產三葉青之間的基因組較為穩定（圖3）。使用滑動窗口計算高度可變區域的核苷酸多樣性，以估計所分析11種葡萄科植物葉綠體基因組中不同區域的差異水平。結果表明，核苷酸多樣性的變化范圍為0～0.234 18，基因間隔區、以及基因變異率最高（圖4），以上結果與mVISTA軟件分析結果一致。

3.6 懷玉山產三葉青RSCU分析

懷玉山產三葉青氨基酸RSCU見表3和圖5。由表3和圖5可知RSCU值大于1.00的密碼子共有30個（終止密碼子除外），其中，有29個以A或U結尾，有1個以G結尾，說明懷玉山產三葉青葉綠體基因組的密碼子偏好以A或U結尾。RSCU值等于1的密碼子有1個，表明該密碼子使用無偏好性。RSCU值大于1.60的密碼子為編碼Ala的GCU、編碼Arg的AGA、編碼Gly的GGA、編碼Leu的UUA、編碼Tyr的UAU、編碼Thr的ACU、編碼Ser的UCU、編碼Met的AUG。RSCU值小于0.60的密碼子包括編碼Ala的GCG、編碼Arg的CGC和CGG、編碼Asn的AAC、編碼Asp的GAC、編碼Cys的UGC、編碼Gln的CAG、編碼Glu的GAG、編碼Gly的GGC、編碼His的CAC、編碼Leu的CUC和CUG、編碼Lys的AAG、編碼Met的GUG、編碼Pro的CCG、編碼Ser的AGC和UCG、編碼Thr的ACG、編碼Tyr的UAC、編碼Val的GUC和GUG。綜上所述，懷玉山產三葉青葉綠體基因組高頻率使用GCU、AGA、GGA、UUA、UAU、ACU、UCU、AUG分別編碼Ala、Arg、Gly、Leu、Tyr、Thr、Ser和Met，低頻率使用GCG、CGC和CGG、AAC、GAC、UGC、CAG、GAG、GGC、CAC、CUC和CUG、AAG、GUG、CCG、AGC和UCG、ACG、UAC、GUC和GUG分別編碼Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Leu、Lys、Met、Pro、Ser、Thr、Tyr和Val。

圖3 11種葡萄科植物葉綠體基因組的可視化比對圖

圖4 11種葡萄科植物葉綠體基因組核苷酸多樣性

表3 懷玉山產三葉青氨基酸的RSCU

Table 3 RSCU of amino acids of T. hemsleyanum from Huaiyu Mountain

密碼子氨基酸 RSCU數量密碼子氨基酸RSCU數量 GCAAla1.101 780 0387UUALeu1.791 490 0842 GCCAla0.643 416 0226UUGLeu1.238 300 0582 GCGAla0.438 434 0154AAALys1.467 320 01044 GCUAla1.816 370 0638AAGLys0.532 677 0379 AGAArg1.911 730 0527AUGMet1.993 800 0643 AGGArg0.634 825 0175GUGMet0.006 201 52 CGAArg1.356 710 0374UUCPhe0.748 021 0567 CGCArg0.362 757 0100UUUPhe1.251 980 0949 CGGArg0.449 819 0124CCAPro1.153 500 0325 CGUArg1.284 160 0354CCCPro0.716 948 0202 AACAsn0.457 358 0303CCGPro0.546 584 0154 AAUAsn1.542 640 01022CCUPro1.582 960 0446 GACAsp0.403 950 0225AGCSer0.353 444 0124 GAUAsp1.596 050 0889AGUSer1.162 950 0408 UGCCys0.577 640 093UCASer1.282 660 0450 UGUCys1.422 360 0229UCCSer0.963 420 0338 CAAGln1.543 270 0740UCGSer0.544 418 0191 CAGGln0.456 726 0219UCUSer1.693 110 0594 GAAGlu1.509 540 01068UAATer1.465 910 043 GAGGlu0.490 459 0347UAGTer0.784 091 023 GGAGly1.640 860 0747UGATer0.750 000 022 GGCGly0.366 831 0167ACAThr1.255 300 0429 GGGGly0.645 799 0294ACCThr0.711 046 0243 GGUGly1.346 510 0613ACGThr0.418 435 0143 CACHis0.486 983 0159ACUThr1.615 220 0552 CAUHis1.513 020 0494UGGTrp1.000 000 0471 AUAIle0.898 172 0688UACTyr0.378 270 0188 AUCIle0.629 243 0482UAUTyr1.621 730 0806 AUUIle1.472 580 01128GUAVal1.488 950 0539 CUALeu0.859 574 0404GUCVal0.527 624 0191 CUCLeu0.425 532 0200GUGVal0.585 635 0212 CUGLeu0.434 043 0204GUUVal1.397 790 0506 CUULeu1.251 060 0588

下面方塊代表編碼每種氨基酸的所有密碼子，上方柱子的高度代表所有密碼子RSCU值的總和

3.7 密碼子組成成分分析

利用Codon W和CUSP在線軟件對11種葡萄科植物葉綠體基因組的88條CDS進行密碼子組成成分分析（圖6）。由圖6可知，11種葡萄科植物的T3和A3含量高于G3含量，表明11種葡萄科植物的第3位堿基以A/T為主。對11種葡萄科植物各基因密碼子的GC含量進行統計分析，發現GC3含量（29.18%）均低于GC1（45.90%）和GC2（39.87%），表明GC在密碼子不同位置上的分布并不均勻，GC1、GC2、GC3呈現不斷降低的趨勢。大部分基因的ENC值都在40以上。ENC的取值大小側面反映了密碼子偏性的強弱，值越高偏性越弱，懷玉山產三葉青各基因的ENC值介于26.167～61.000，平均值為46.88，其中ENC值大于45的有59個，小于45的僅有29個，表明懷玉山產三葉青葉綠體基因組密碼子具有較強的偏好性。

3.8 GC3-GC12分析

11種葡萄科植物葉綠體基因組密碼子GC3-GC12分析分析結果見圖7。由圖7可知，GC3-GC12分析發現11種葡萄科植物葉綠體基因的GC3含量分布在0.15～0.50，GC12含量分布在0.30～0.60，二者的分布范圍都比較集中，且沿著對角線上方分布。兩者的相關系數＝0.01（2＝0.000 1），相關顯著，表明密碼子偏好性主要受突變影響，受選擇因素影響較小。回歸曲線斜率為0.015 2，說明密碼子第1、2位與第3位堿基組成偏好性差異較小，突變對密碼子偏好性的影響較強，而其他因素，如自然選擇可能對密碼子的偏好性影響較小。

3.9 ENC-plot分析

ENC-plot分析主要用于判斷密碼子偏好性是否被突變或選擇等因素影響，11種葡萄科植物的ENC-plot分析見圖8。由圖8可知，部分基因位點沿標準曲線分布或落在標準曲線附近，表明這些基因實際ENC值與預期值相近；另外一部分基因位點落在期望值的下方，說明實際ENC值與預期ENC值之間存在差異，說明11種葡萄科植物葉綠體基因組有一部分基因的密碼子偏好性受到突變的影響較大，而受到選擇效應的影響相對較小。

3.10 PR2-plot分析

通過PR2-plot分析，11種葡萄科植物葉綠體基因組中由4個密碼子編碼的氨基酸家族中第3位上嘌呤（A、G）和嘧啶（T、C）的使用情況見圖9。

GC12表示密碼子第1、2位GC含量的平均值；GC3表示密碼子第3位的GC含量 A～K分別代表懷玉山產三葉青、浙江產三葉青、扁擔藤、毛五葉崖爬藤、Tetrastigma rafflesiae、Tetrastigma lawsonii、烏蘞莓、祖提葡萄翁、矮葡萄翁、Cyphostemma adenopodum和桑德森葡萄翁，下同

圖7 11種葡萄科植物葉綠體基因組密碼子GC3-GC12分析

由圖9可知，基因不均勻地分布于平面圖的4個區域內，平面圖左上方基因分布較多，說明密碼子第3位堿基的使用存在偏性，而且T的使用頻率低于A，C的使用頻率高于G。當密碼子使用偏好只受突變影響時，4種堿基的使用頻率應相等。因此，11種葡萄科植物葉綠體基因組密碼子使用模式不僅受到突變影響，同時還受到如選擇壓力等其他因素的影響。

圖8 11種葡萄科植物葉綠體基因組密碼子ENC-plot分析

3.11 最優密碼子確定

對懷玉山產三葉青葉綠體基因的ENC值進行排序，分別選取兩端基因各5個，構建高表達基因庫（ENC值小）和低表達基因庫（ENC值大），并計算二者的RSCU差值（ΔRSCU）。篩選ΔRSCU≥0.08的高表達密碼子，且RSCU＞1的高頻率密碼子定義為懷玉山產三葉青葉綠體基因組的最優密碼子（表4）。由表4可知，懷玉山產三葉青有31個高頻密碼子，16個以U結尾，13個以A結尾，2個以G結尾，其中有13個為最優密碼子（6個以U結尾，7個以A結尾）。

圖9 11種葡萄科植物葉綠體基因組密碼子PR2-plot分析

3.12 葡萄科植物系統發育分析

基于6個崖爬藤屬種類1個烏蘞莓屬種類、4個葡萄翁屬種類、1個牛果藤屬種類和1個菱葉藤屬種類的葉綠體基因組構建的系統發育樹見圖10。由圖10可知，在崖爬藤屬植物中，懷玉山產三葉青（SYQ）、浙江產三葉青（NC_029339）、扁擔藤、毛五葉崖爬藤、、和烏蘞莓聚為一大支；祖提葡萄翁、矮葡萄翁、、桑德森葡萄翁聚為一支；牛果藤和菱葉藤聚為一大支，但懷玉山產三葉青與浙江產三葉青聚為一小支。說明聚在一支的崖爬藤屬植物種類親緣關系較近，崖爬藤屬植物與烏蘞莓屬、葡萄翁屬、牛果藤屬和菱葉藤屬植物親緣關系較遠。

表4 懷玉山產三葉青葉綠體基因最優密碼子篩選

Table 4 Screening of optimal codons for chloroplast genes of T. hemsleyanum from Huaiyu Mountain

密碼子氨基酸RSCU數量RSCU低表達數量RSCU高表達數量RSCU差值 GCUAla1.816 37638 1.655 170121.655 170 UUALeu1.791 498421.034 48051.866 670140.832 190 UCUSer1.693 115940.272 72711.785 710101.512 983 GGAGly1.640 867471.333 33062.074 070140.740 740 GAUAsp1.596 058890.800 00021.428 570100.628 570 CCUPro1.582 964461.538 46051.882 350 80.343 890 CAAGln1.543 277401.200 00031.733 330130.533 330 GUAVal1.488 955391.142 86041.454 550120.311 690 UAATer1.465 91430.600 00011.200 000 30.600 000 CGUArg1.284 163540.833 33351.315 790 50.482 457 UCASer1.282 664501.636 36061.964 290110.327 930 UUUPhe1.251 989491.230 77081.680 000210.449 230 CCAPro1.153 503250.615 38520.705 882 30.090 497

圖10 基于葉綠體基因組的葡萄科13個種類的系統發育樹

基于8個三葉崖爬藤[懷玉山產三葉青（SYQ）、福建產三葉青（MW375708）、廣西產三葉青（MW375709）、浙江產三葉青（MT827073）、浙江產三葉青（MW375707）、浙江產三葉青（KT033563）（NC_029339）、四川三葉青（MW375710）、浙江產三葉青（MW375711）]、扁擔藤、毛五葉崖爬藤、、Wen12461牛果藤和菱葉藤的葉綠體基因組構建的系統發育樹見圖11。由圖11可知，三葉青聚為2大類，其中一類包括福建產三葉青（MW375708）、廣西產三葉青（MW375709）、浙江產三葉青（MT827073）、浙江產三葉青（MW375707）和浙江產三葉青（KT033563）（NC_029339），另一類包括四川三葉青（MW375710）和浙江產三葉青（MW375711）。而在第一類中，浙江產三葉青KT033563（NC_029339）單獨成一小支，浙江產三葉青（MT827073）和浙江產三葉青（MW375707）單獨成一小支，懷玉山產三葉青（SYQ）、福建產三葉青MW375708和廣西產三葉青（MW375709）單獨成一小支。說明懷玉山產三葉青（SYQ）、福建產三葉青（MW375708）和廣西產三葉青（MW375709）親緣關系較近。

圖11 基于葉綠體基因組的葡萄科15個種類的系統發育樹

4 討論

葉綠體是高等植物光合作用和碳固定的重要細胞器，起到能量轉換的作用[13]。在葉綠體基因組中以若干小簇的形式排列的光合作用基因如-、-、-、-、---和---等屬于轉錄單位和調控單位，如葉綠體中的基因都具轉錄活性，可編碼NADH-質體醌（PQ）氧化還原酶，當用PQ氧化抑制劑阻斷光合系統I和II之間的電子傳遞通道時，葉綠體呼吸的電子傳遞則不受影響；葉綠體的和基因可編碼膜上輸送各種代謝物質的蛋白質；約有一半的葉綠體基因包括rRNA、tRNA、RNA多聚酶和核糖體蛋白質等基因協同核基因參與到葉綠體蛋白質的合成；葉綠體基因如tRNA和蛋白質基因均含有內含子，在表達過程中需要對轉錄后的RNA分子進行拼接加工[14]。

植物葉綠體基因組長約107～218 kb，其長短取決于IR區的收縮和擴張[15]。本研究所獲得的懷玉山產三葉青葉綠體基因組大小與結構與已報道的被子植物研究結果相符。懷玉山產三葉青葉綠體基因組長160 165 bp，是一個典型的四分體結構，與浙江產三葉青（159 914 bp）[9-10]、浙江舟山三葉青（152 281 bp）差異小。懷玉山產三葉青葉綠體基因組GC含量為37.50%，與浙江舟山三葉青葉綠體基因組中GC含量（37.5%）一致，與浙江產三葉青葉綠體基因組中GC含量（37.55%）有些差異，懷玉山產三葉青葉綠體基因組IRs區中GC含量達到最高（42.98%），與浙江舟山三葉青IRs中GC含量42.9%有差異[9-10]。懷玉山產三葉青葉綠體基因組LSC區88 172 bp，SSC區18 963 bp，IRs區26 515 bp，與浙江產三葉青（LSC：87 927 bp、SSC：18 967 bp、IRs：26 510 bp）、浙江舟山三葉青（LSC：88 185 bp、SSC：18 966 bp、IRs：26 519 bp）遺傳差異很小，LSC區域10～250 bp，SSC和IRs區域相差1～10 bp[9-10]。

通過IRscope比較分析，發現葡萄科的11個物種葉綠體基因組結構和大小差異較大，SC和IR邊界有明顯區別，基因和基因不同程度的擴張和伸縮導致了11個物種間的IR和SSC區長度差異。反向重復區域經常出現假基因化，在懷玉山產三葉青葉綠體基組中，基因有2個，分別橫跨JSB邊界和JSA邊界，位于JSA邊界的基因長度為5633 bp（浙江舟山三葉青為5634 bp），為正常基因；位于JSB邊界的基因長度為1199 bp（浙江舟山三葉青為1200 bp），位于JS邊界的基因的3’端SS區發生缺失，僅有56 bp，位于JSB邊界的基因為一個假基因[9]。有研究表明，陰暗潮濕等環境因子的自然選擇，等基因選擇壓力存在差異，導致等基因的進化速率也存在差異[16-17]，這類進化速率存在差異的等基因，可以組合成為DNA條形碼用來分析崖爬藤屬植物的系統發育[18]。

懷玉山產三葉青葉綠體基因組共注釋出133個基因，包括88個基因、37個tRNA基因和8個rRNA基因，這與浙江舟山三葉青葉綠體基因組的基因注釋結果[9]一致。懷玉山產三葉青葉綠體基因組沒有檢測到內含子，僅個別基因具1～2個含子。其中基因具2個內含子，而浙江舟山三葉青葉綠體基因組和基因具2個內含子，且懷玉山產三葉青葉綠體基因組沒有注釋到基因。值得一提的是懷玉山產三葉青葉綠體基因組注釋到6個未知功能基因[（2）、（2）、（2）]，而浙江舟山三葉青葉綠體基因組未知功能基因有7個，注釋到了1個基因[9]。基因和基因可能是造成懷玉山產三葉青與浙江舟山三葉青品質差異的2個候選基因，其功能需進一步利用先進的分子技術手段對其功能進行鑒定。在本研究中，基于VISTA tools和DNADnaSP6.0軟件分析結果表明，在11種葡萄科植物存在一些變異率較高的區段，如、以及基因等，今后這些變異熱點區段，或許可以也作為新的DNA條形碼，用于崖爬藤屬植物的物種鑒定和系統發育關系等方面的研究[9]。

葉綠體SSR為短的單核苷酸串聯重復序列，位于葉綠體基因組非編碼區域時，通常顯示種內變異重復次數[19]，在同一物種表現高度變異，廣泛用于群體遺傳學和系統發育分析等領域[20-21]。懷玉山產三葉青葉綠體基因組共檢測到63個SSR位點，單堿基重復有56個，雙堿基重復有7個，其中，單重復單元為A或T重復頻率為10的SSR位點數量最多，重復單元為A/T的最高重復頻率最高，這與其他植物科[22]中的報道一致，懷玉山產三葉青葉綠體基因組SSR位點可為崖爬藤屬物種分子標記開發及物種鑒定提供理論依據。

核酸組成成分顯著影響核基因密碼子使用偏好性，自然選擇和變異方向在葉綠體基因組密碼子使用偏好性中起到重要作用[23]。在本研究中，懷玉山產三葉青葉綠體基因組RSCU值大于1.00的密碼子共有30個（終止密碼子除外），其中有29個以A或U結尾，有1個以G結尾，這一結果與大多數被子植物葉綠體基因組的研究結果類似，都偏好使用A或U結尾的密碼子[24-25]。以葉綠體基因組為對象，RSCU值＞1.60時，為高使用頻率密碼子，RSCU值＜0.60時為低使用頻率密碼子[26]，在本研究中，懷玉山產三葉青葉綠體基因組高頻率使用GCU、AGA、GGA、UUA、UAU、ACU、UCU、AUG分別編碼Ala、Arg、Gly、Leu、Tyr、Thr、Ser和Met，低頻率使用GCG、CGC和CGG、AAC、GAC、UGC、CAG、GAG、GGC、CAC、CUC和CUG、AAG、GUG、CCG、AGC和UCG、ACG、UAC、GUC和GUG分別編碼Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Leu、Lys、Met、Pro、Ser、Thr、Tyr和Val。假設核苷酸堿基變異發生在密碼子第3位，那么在基因或基因組中簡并密碼子A、T和C、G所占比例相當[27]。本研究通過PR2-plot分析發現，基因不均勻地分布于平面圖的4個區域內，平面圖左上方基因分布較多，密碼子第3位堿基的使用存在偏性，T使用頻率低于A，C使用頻率高于G，說明懷玉山產三葉青葉綠體基因組受堿基突變和自然選擇的雙重影響。本研究GC3-GC12分析表明，密碼子第1、2位與第3位堿基組成偏好性差異較小，突變對密碼子偏好性的影響較強，而其他因素如自然選擇可能對密碼子的偏好性影響較小。有研究表明，低等生物體中如細菌和古生菌，富含GC的物種通常擁有GC含量較高的最優密碼子[28]；反之，富含AU的物種，最優密碼子AU含量較高[29]。本研究結果與此一致，懷玉山產三葉青有31個高頻密碼子，16個以U結尾，13個以A結尾，2個以G結尾，其中有13個為最優密碼子（6個以U結尾，7個以A結尾），最優密碼子多以A或U堿基結尾，可為葉綠體是通過內共生方式從藍細菌進化而來的觀點提供依據[30]。

葉綠體基因組信息量較大，且其結構、大小和基因組成相對恒定，已廣泛應用于系統進化分析。蔣明等[9]和Li等[10]分別構建了三葉崖爬藤、赤蒼藤、葡萄、夏葡萄、東北蛇葡萄、槭葉葡萄等12種植物和三葉崖爬藤、葡萄等40種植物葉綠體基因組的系統發生樹，均發現崖爬藤屬的三葉崖爬藤單獨聚為一組，與葡萄屬較為接近。本研究結果與此研究結果一致，本研究構建了6個崖爬藤屬種類、1個烏蘞莓屬種類、4個葡萄翁屬種類、1個牛果藤屬種類和1個菱葉藤屬種類葉綠體基因組的系統發育樹，發現懷玉山產三葉青與浙江產三葉青聚為一小支，說明聚在一支的崖爬藤屬植物種類親緣關系較近，崖爬藤屬植物與烏蘞莓屬、葡萄翁屬、牛果藤屬和菱葉藤屬植物親緣關系較遠。本研究還構建了懷玉山產三葉青、福建產三葉青、廣西產三葉青、浙江產三葉青、四川三葉青葉綠體基因組構建的系統發育樹，發現懷玉山產三葉青、福建產三葉青和廣西產三葉青聚為一小支，說明懷玉山產三葉青與福建產三葉青和廣西產三葉青親緣關系較近，與浙江產三葉青、四川三葉青和浙江產三葉青親緣關系較遠，說明三葉青之間的親緣關系與地理位置相關性不大，這也證實了尹明華等[31]利用SSR熒光標記分析三葉青64個種質遺傳多樣性和親緣關系的結論。本研究獲得了懷玉山產三葉青葉綠體基因組的基本信息及其系統發育關系，為懷玉山產三葉青的遺傳多樣性保護、生產性狀、系統演化等相關研究提供數據基礎，也為懷玉山產三葉青種質鑒定、DNA條形碼開發提供了新思路。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] Zhan L H, Pu J B, Zheng J R,.Diels et Gilg ameliorates lipopolysaccharide induced sepsis via repairing the intestinal mucosal barrier [J]., 2022, 148: 112741.

[2] Yang L, Shi Y S, Ruan X,. Salt interferences to metabolite accumulation, flavonoid biosynthesis and photosynthetic activity in[J]., 2022, 194: 104765.

[3] Liu Y Y, Li Y L, Chen W,.flavones exert antihepatic carcinoma property both in vitro and in vivo [J]., 2021, 5: 9-16.

[4] Bobik K, Burch-Smith T M. Chloroplast signaling within, between and beyond cells [J]., 2015, 6: 781.

[5] Shahzadi I, Abdullah, Mehmood F,. Chloroplast genome sequences ofand: Comparative analyses, mutational hotspots in genus Artemisia and phylogeny in family Asteraceae [J]., 2020, 112(2): 1454-1463.

[6] Liu Y C, Li Y T, Feng S X,. Complete chloroplast genome structure of four Ulmus species andand comparative analysis within Ulmaceae species [J]., 2022, 12(1): 15953.

[7] Meng J, Li X P, Li H T,. Comparative analysis of the complete chloroplast genomes of four Aconitum medicinal species [J]., 2018, 23(5): 1015.

[8] 孫健, 沈曉霞, 陳加紅, 等. 藥用植物三葉青種質多樣性與栽培管理的研究進展 [J]. 科技通報, 2018, 34(1): 13-17.

[9] 蔣明, 王軍峰, 應夢豪, 等. 三葉崖爬藤葉綠體基因組的組裝與序列分析 [J]. 中草藥, 2020, 51(2): 461-468.

[10] Li M Z, Chen Q Y, Yang B X,. The complete chloroplast genome sequence ofDiels at Gilg [J]., 2016, 27(5): 3729-3730.

[11] 尹明華, 謝妮妮, 徐文慧, 等. 三葉青種質資源遺傳多樣性的ISSR分析 [J]. 中草藥, 2018, 49(20): 4884-4891.

[12] 林國衛, 聞靜, 石光禹, 等. 侵染懷玉山產三葉青的病毒RT-PCR鑒定 [J]. 分子植物育種, 2020, 18(3): 968-975.

[13] Neuhaus H E, Emes M J. Nonphotosynthetic metabolism in plastids [J]., 2000, 51: 111-140.

[14] Grevich J J, Daniell H. Chloroplast genetic engineering: Recent advances and future perspectives [J]., 2005, 24(2): 83-107.

[15] Yu J Y, Xia M Z, Xu H,. The complete chloroplast genome sequence of(Asteraceae) [J]., 2021, 6(2): 430-431.

[16] Yang X F, Wang Y T, Chen S T,. PBR1 selectively controls biogenesis of photosynthetic complexes by modulating translation of the large chloroplast gene Ycf1 in[J]., 2016, 2: 16003.

[17] Vitti J J, Grossman S R, Sabeti P C. Detecting natural selection in genomic data [J]., 2013, 47: 97-120.

[18] 裴男才. 利用植物DNA條形碼構建亞熱帶森林群落系統發育關系: 以鼎湖山樣地為例 [J]. 植物分類與資源學報, 2012, 34(3): 263-270.

[19] Provan J, Powell W, Hollingsworth P M. Chloroplast microsatellites: New tools for studies in plant ecology and evolution [J]., 2001, 16(3): 142-147.

[20] Wills D M, Hester M L, Liu A Z,. Chloroplast SSR polymorphisms in the Compositae and the mode of organellar inheritance in[J]., 2005, 110(5): 941-947.

[21] Ebrahimi A, Zarei A, Zamani F M,. Evaluation of genetic variability among early mature Juglans regia using microsatellite markers and morphological traits [J]., 2017, 5: e3834.

[22] 孫哲, 李澳旋, 杜曉蓉, 等. 房山紫堇葉綠體基因組特征及其系統進化關系 [J]. 草地學報, 2022, 30(8): 1982-1989.

[23] Pechmann S, Frydman J. Evolutionary conservation of codon optimality reveals hidden signatures of cotranslational folding [J]., 2013, 20(2): 237-243.

[24] 楊亞蒙, 焦健, 樊秀彩, 等. 桑葉葡萄葉綠體基因組及其特征分析 [J]. 園藝學報, 2019, 46(4): 635-648.

[25] Zhou M, Long W, Li X. Patterns of synonymous codon usage bias in chloroplast genomes of seed plants [J]., 2008, 10(4): 235-242.

[26] Mukhopadhyay P, Basak S, Ghosh T C. Nature of selective constraints on synonymous codon usage of rice differs in GC-poor and GC-rich genes [J]., 2007, 400(1/2): 71-81.

[27] Liu Q P, Xue Q Z. Comparative studies on codon usage pattern of chloroplasts and their host nuclear genes in four plant species [J]., 2005, 84(1): 55-62.

[28] Nekrutenko A, Li W H. Assessment of compositional heterogeneity within and between eukaryotic genomes [J]., 2000, 10(12): 1986-1995.

[29] Hershberg R, Petrov D A. General rules for optimal codon choice [J]., 2009, 5(7): e1000556.

[30] Raven J A, Allen J F. Genomics and chloroplast evolution: What did cyanobacteria do for plants? [J]., 2003, 4(3): 209.

[31] 尹明華, 徐文慧, 謝妮妮, 等. 三葉青種質資源遺傳多樣性的SSR熒光標記分析 [J]. 中草藥, 2018, 49(23): 5649-5656.

Phylogenetic relationship and characterization of chloroplast genome offrom Huaiyu Mountain

HONG Sen-rong1, 2, 3, 4, LIU Wen-li1, SONG Bing-yan1, YAN Yu-qing1

1. College of Life Sciences, Shangrao Normal University, Shangrao 334001, China 2. Shangrao Agricultural Technology Innovation Research Institute, Shangrao 334001, China 3. Key Laboratory of protection and utilization of medicinal and edible plant resources in Shangrao City, Shangrao 334001, China 4. ShangraoDiels et Gilg Conservation and Utilization Technology Innovation Center, Shangrao 334001, China

To analyze the genomic information sequence characteristics of the chloroplast offrom Huaiyu Mountain and determine its systematic position in the genus of.The chloroplast genome sequence offrom Huaiyu Mountain was obtained by sequencing with Illumina high throughput sequencing platform NovaSeq6000, and bioinformatics tools such as GeSeq, tRNAscan SE, MISA, VISTA tools, DNADnaSP6.0, JSHYCloud, CodonW1.4.2, Pasteur Galaxy, Mafft 7.0, fasttree 2.1.10 were used for sequence analysis, codon preference analysis, genome comparative analysis and phylogenetic research of.The chloroplast genome offrom Huaiyu Mountain is a covalently closed double stranded ring molecule with a length of 160 165 bp, including 1 LSC, 1 IRa, 1 IRb and 1 SSC; the chloroplast genome offrom Huaiyu Mountain has been annotated with 133 genes in four categories: photosynthesis genes, self-replication genes, other genes and unknown functional genes, including 88 CDS genes, 37 tRNA genes and eight rRNA genes; Sixty three SSR loci were detected in the chloroplast genome offrom Huaiyu Mountain, including 56 single base repeats and seven double base repeats; The variation range of nucleotide diversity of the chloroplast genome offrom Huaiyu Mountain was 0—0.234 18, and the variation rates of,and genewere the highest. The codon of chloroplast genome offrom Huaiyu Mountain had a strong preference for ending in A or U. Mutation had a strong impact on codon preference, while other factors such as natural selection had a small impact on codon preference. The chloroplast genome offrom Huaiyu Mountain had 31 high-frequency codons, 16 ending in U, 13 ending in A, and two ending in G, of which 13 were the optimal ones.from Huaiyu Mountain was close tofrom Fujian MW375708 andfrom Guangxi MW375709, and far fromfrom Zhejiang MT827073,from Zhejiang MW375707,from Zhejiang KT033563 (NC_029339),from Sichuan MW375710 andfrom Zhejiang MW375711, which showed that there was little correlation between the genetic relationship and the geographical location.The genetic relationship betweenis not closely related to its geographical location. In this study, the chloroplast genome offrom Huaiyu Mountain is analyzed comprehensively and deeply for the first time by using bioinformatics analysis method, which will provide theoretical basis for genetic diversity analysis of medicinal plants and genetic breeding research of new strains of.

Diels et Gilg; characterization of chloroplast genome; phylogenetic relationship; large single copy region; small single copy region

R286.12

A

0253 - 2670(2023)16 - 5358 - 14

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.16.025

2023-02-03

國家自然科學基金資助項目（31960079）；2022年上饒市科技專項項目（饒科發[2023]5號社發類）（2022A008）；江西省科技廳重點研發計劃一般項目（20202BBG73010）；江西省教育廳科學技術研究項目（GJJ201704）；上饒市科技局平臺載體建設項目（2020J001）

洪森榮（1974—），教授，主要從事植物生物技術研究工作。Tel: (0793)8153721 E-mail: hongsenrong@163.com

[責任編輯 時圣明]