奇楠沉香中2個(gè)新的桉烷型倍半萜類化合物

陳德力，馬國(guó)需, 2，劉會(huì)梅，王燦紅，楊 云，劉洋洋*，魏建和, 2*

?化學(xué)成分 ?

奇楠沉香中2個(gè)新的桉烷型倍半萜類化合物

陳德力1，馬國(guó)需1, 2，劉會(huì)梅1，王燦紅1，楊 云1，劉洋洋1*，魏建和1, 2*

1. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所海南分所，海南 海口 570311 2. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193

研究奇楠沉香中具有神經(jīng)細(xì)胞損傷保護(hù)作用的活性化合物。利用硅膠柱色譜、半制備液相色譜等現(xiàn)代色譜技術(shù)進(jìn)行分離純化，結(jié)合核磁共振和質(zhì)譜等現(xiàn)代譜學(xué)手段鑒定其結(jié)構(gòu)，同時(shí)體外法測(cè)定化合物對(duì)皮質(zhì)酮（corticosterone）誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。從奇楠沉香超臨界提取物中分離得到2個(gè)桉烷型倍半萜類化合物，分別鑒定為(7,8,10)-(+)-8-hydroxy-selina-4,11-dien-12,15-dial（1）和(7,8,10)-(+)-8,11-dihydroxy-selina-4-en-15-al（2）；體外對(duì)PC12細(xì)胞損傷存活率顯著升高。化合物1和2為新化合物，分別命名為奇楠醇A和奇楠醇B，均對(duì)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷具有一定的保護(hù)作用。

奇楠；沉香；白木香；桉烷型倍半萜；神經(jīng)保護(hù)；奇楠醇A；奇楠醇B

焦慮和抑郁等常見(jiàn)的神經(jīng)精神性疾病，已成為危害人類健康的第二大疾病，且其病因病機(jī)復(fù)雜多變，并多伴有嚴(yán)重并發(fā)癥[1]。沉香為瑞香科（Thymelaeaceae）植物白木香(Lour.) Spreng傷害誘導(dǎo)防御反應(yīng)形成的含有樹(shù)脂的木材，是我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中常用的理氣藥，具有行氣止痛、溫中止嘔、納氣平喘、益氣和神的功效，通過(guò)吸入揮發(fā)性香氣物質(zhì)起到鎮(zhèn)靜安神、調(diào)節(jié)睡眠作用[2-3]。現(xiàn)代藥理研究表明，沉香提取物或單體化合物具有較好的鎮(zhèn)靜催眠、抗焦慮、抗抑郁和抗神經(jīng)炎作用[4-9]。課題組前期亦明確沉香揮發(fā)性成分或醇提物具有顯著鎮(zhèn)靜促睡眠、抗焦慮和抗抑郁的作用[10-14]。普通沉香的化學(xué)成分和藥理作用已有大量研究[15-17]，而奇楠沉香因其獨(dú)特的芳香氣味和性狀而區(qū)別于普通沉香，被認(rèn)為是最具有上等品質(zhì)和珍貴價(jià)值的沉香，現(xiàn)已開(kāi)始批量上市銷售，本課題組研究表明其物種仍為白木香，是一種新的化學(xué)型[18-19]，其研究報(bào)道較少。因此，從奇楠沉香中挖掘具有神經(jīng)調(diào)控或保護(hù)作用的先導(dǎo)活性分子，具有重要的科學(xué)研究意義。

課題組為了進(jìn)一步了解奇楠沉香揮發(fā)性成分，并從中挖掘具有神經(jīng)保護(hù)作用的潛在藥物分子，對(duì)其超臨界提取物進(jìn)行了分離純化，采用波譜學(xué)技術(shù)手段鑒定了2個(gè)新化合物，分別鑒定為(7,8,10)- (+)-8-hydroxy-selina-4,11-dien-12,15-dial（1）和(7,8,10)-(+)-8,11-dihydroxy-selina-4-en-15-al（2），均為桉烷型倍半萜類化合物（圖1）。同時(shí)，采用體外法評(píng)價(jià)化合物對(duì)皮質(zhì)酮（corticosterone）誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，發(fā)現(xiàn)化合物1和2可保護(hù)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷。

圖1 化合物1和2的結(jié)構(gòu)

1 儀器與材料

Bruker Avance III 600型核磁共振波譜儀（德國(guó)布魯克公司），高分辨質(zhì)譜儀Q-tof（美國(guó)沃特世公司），Nicolet iS5 FT-IR型傅里葉紅外光譜儀（美國(guó)賽默飛公司），Photophysics Chirascan圓二色譜儀（英國(guó)應(yīng)用光物理公司），MCP200型自動(dòng)旋光儀（德國(guó)安東帕公司）。BS110S型分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司），P230型高壓半制備液相色譜儀（大連依利特分析儀器有限公司），DAD230＋二極管陣列大連檢測(cè)器（大連依利特分析儀器有限公司），RE-5299型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠），超聲波清洗儀（深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司）。SB-Phenyl色譜柱（250 mm×9.4 mm，5 μm，安捷倫公司），柱色譜用硅膠（100～200目，青島海洋化工有限公司），薄層色譜用硅膠G、H、GF254（青島海洋化工有限公司），水（杭州哇哈哈集團(tuán)有限公司），石油醚、醋酸乙酯、二氯甲烷、甲醇等常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

奇楠沉香CO2超臨界提取物（100.0 g）由瑜豐沉香匯（廣東）科技有限公司提供。奇楠沉香產(chǎn)自廣東茂名，經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所海南分所劉洋洋研究員鑒定為奇楠種質(zhì)沉香(Lour.) Spreng。

2 方法

2.1 提取與分離

奇楠沉香CO2超臨界提取物（100.0 g）總浸膏經(jīng)100～200目硅膠柱色譜分離，使用石油醚-醋酸乙酯溶劑系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫（40∶1、30∶1、20∶1、15∶1、10∶1、8∶1、6∶1、3∶1、1∶1、0∶1），得到Fr. A～J。其中Fr. H部位（石油醚-醋酸乙酯3∶1）經(jīng)半制備高效液相色譜分離純化得到化合物1（9.8 mg，R＝17.2 min，甲醇-水65∶35，體積流量2.0 mL/min）；Fr. G部位（石油醚-醋酸乙酯6∶1）經(jīng)半制備高效液相色譜分離純化得到化合物2（2.4 mg，R＝17.7 min，甲醇-水60∶40，體積流量2.0 mL/min）。半制備高效液相檢測(cè)波長(zhǎng)均為210 nm。

2.2 神經(jīng)保護(hù)活性篩選

體外法測(cè)定化合物對(duì)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用[20]。PC12細(xì)胞按常規(guī)方法培養(yǎng)，在96孔板中接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，使細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/mL，每孔加入100 μL，置于37 ℃含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。設(shè)置對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照地西泮組、實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組中加入200 μL不完全培養(yǎng)基不做任何處理；模型組只用200 μL的皮質(zhì)酮（終濃度為200 μmol/L）處理；實(shí)驗(yàn)組以100 μL的皮質(zhì)酮（終濃度為200 μmol/L）和相應(yīng)藥物（50、25、12.5、6.25、3.125、1.562 5 μg/mL）處理，陽(yáng)性對(duì)照組地西泮（地西泮產(chǎn)生毒性的血藥濃度為30 μg/mL，故給藥劑量設(shè)其1/10劑量3.125 μg/mL）100 μL處理細(xì)胞。置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h，小心吸取100 μL的含藥培養(yǎng)基，加入CCK8 10 μL，置于37 ℃含5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育2 h后，將96孔板置于酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（）值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率＝(實(shí)驗(yàn)－空白)/(對(duì)照－空白)

3 結(jié)果與分析

3.1 結(jié)構(gòu)鑒定

表1 化合物1和2的1H-和13C-NMR數(shù)據(jù)(600/150 MHz, CDCl3)

Table 1 1H- and 13C-NMR data of compounds 1 and 2 (600/150 MHz, CDCl3)

碳位12δHδCδHδC 11.63 (m), 1.42 (m)39.11.62 (m), 1.38 (m)39.0 21.60 (m), 1.42 (m)17.61.60 (m), 1.45 (m)17.6 32.38 (m), 2.06 (d, J = 4.2 Hz)23.82.37 (dd, J = 15.6, 4.8 Hz), 2.00 (d, J = 4.2 Hz)23.9 4 133.7 133.3 5 160.3 161.4 63.34 (dd, J = 8.4, 3.6 Hz), 2.44 (dt, J = 14.4, 2.4 Hz)27.93.37 (dd, J = 14.4, 3.6 Hz), 1.85 (t, J = 3.0 Hz)25.1 72.58 (td, J = 10.2, 3.6 Hz)46.71.60 (m)55.0 84.14 (td, J = 10.8, 4.2 Hz)68.84.20 (td, J = 10.8, 4.2 Hz)68.5 92.04 (d, J = 4.2 Hz), 1.44 (m)50.01.98 (d, J = 4.2 Hz), 1.40 (m)50.0 10 38.3 37.9 11 150.2 75.2 129.61 (s)195.11.33 (s)23.8 136.47 (s), 6.23 (s)136.21.34 (s)30.3 141.27 (s)26.11.21 (s)26.1 1510.11 (s)191.010.17 (s)190.7

圖2 化合物1和2的關(guān)鍵1H-1H COSY () 和HMBC () 相關(guān)

化合物1的相對(duì)構(gòu)型由NOESY譜圖。在NOESY譜圖中，H-8與H-14/H-9a/H-6a存在相關(guān)，表明他們處于同側(cè)；H-7與H-9b存在NOE相關(guān)，H-7與H-8未觀察到NOE增益，結(jié)合兩者的偶合常數(shù)（3＞9.0）進(jìn)一步證明兩者處于反式。為了進(jìn)一步確定其絕對(duì)構(gòu)型，參考該類化合物的生物合成途徑以及在B3LYP/6-31 G (d) 基組水平的計(jì)算ECD圖譜與化合物1的實(shí)驗(yàn)圖譜一致（圖3），確定其絕對(duì)構(gòu)型為7,8,10-1。經(jīng)文獻(xiàn)檢索，確定該化合物為新化合物，鑒定為(7,8,10)-(+)-8-hydroxy-selina- 4,11-dien-12,15-dial，命名為奇楠醇A。

圖3 化合物1和2的實(shí)測(cè)和計(jì)算ECD譜圖

3.2 活性測(cè)試結(jié)果

體外測(cè)定化合物對(duì)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)活性結(jié)果表明，皮質(zhì)酮誘導(dǎo)損傷的PC12細(xì)胞存活率為48.8%，與陽(yáng)性對(duì)照藥地西泮相比（皮質(zhì)酮誘導(dǎo)細(xì)胞損傷后的細(xì)胞存活率為85.2%），化合物1和2在25.0 μg/mL時(shí)，對(duì)損傷后的PC12細(xì)胞的存活率分別為83.4%、86.2%；在12.5 μg/mL時(shí)，化合物1和2對(duì)損傷后的PC12細(xì)胞的存活率分別為72.4%、76.3%；在6.25 μg/mL時(shí)，化合物1和2對(duì)損傷后的PC12細(xì)胞的存活率分別為57.5%、63.8%；表明化合物1和2對(duì)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)損傷的PC12細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用。

4 討論

沉香中含有結(jié)構(gòu)類型豐富的倍半萜類化合物，主要包括桉烷型、艾里莫芬烷型和愈創(chuàng)木烷型等。該研究利用多種現(xiàn)代色譜技術(shù)結(jié)合譜學(xué)手段，從奇楠沉香超臨界提取物中分離并鑒定了2個(gè)桉烷型倍半萜類化合物，均為新化合物。同時(shí)，體外法測(cè)定化合物對(duì)CORT誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，發(fā)現(xiàn)化合物1和2均具有一定的神經(jīng)細(xì)胞損傷保護(hù)活性。綜上，本研究結(jié)果豐富了奇楠沉香超臨界提取物的化學(xué)成分，為其開(kāi)發(fā)利用提供了參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 弓寶, 王燦紅, 吳玉蘭, 等. 沉香熏香吸入抗焦慮、抗抑郁作用及其機(jī)制研究 [J]. 中國(guó)中藥雜志, 2023, 48(4): 1023-1031.

[2] 中國(guó)藥典[S]. 一部. 2020: 192.

[3] 李時(shí)珍. 本草綱目(第二冊(cè)) [M]. 校點(diǎn)本. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 1979: 1939.

[4] Huo H X, Zhu Z X, Pang D R,. Anti-neuroinflammatory sesquiterpenes from Chinese eaglewood [J]., 2015, 106: 115-121.

[5] 史圣華, 金星, 莫日根. 廣棗七味散、十三味檳榔散、沉香四味散抗抑郁作用的實(shí)驗(yàn)研究 [J]. 中國(guó)民族醫(yī)藥雜志, 2012, 18(5): 41-43.

[6] 侯金良, 張媛媛, 張浩, 等. 沉香片劑小鼠口鼻吸入給藥抗焦慮和催眠功效實(shí)驗(yàn)研究 [J]. 山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2021, 45(1): 113-119.

[7] Kao W Y, Hsiang C Y, Ho S C,. Novel serotonin- boosting effect of incense smoke from Kynam agarwood in mice: The involvement of multiple neuroactive pathways [J]., 2021, 275: 114069.

[8] 梁宇, 孔德文, 周啟蒙, 等. 沉香氣體吸入給藥通過(guò)影響神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)節(jié)小鼠睡眠的作用研究 [J]. 中藥藥理與臨床, 2019, 35(6): 71-77.

[9] 雷莉, 張婷, 高東, 等. 沉香熏香療法對(duì)失眠障礙患者的臨床療效研究 [J]. 中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志, 2019, 36(7): 609-612.

[10] 王帥, 周岳, 馬富超, 等. 通體沉香對(duì)小鼠催眠和自主活動(dòng)抑制作用 [J]. 國(guó)際藥學(xué)研究雜志, 2016, 43(6): 1082-1087.

[11] Wang C H, Wang Y Y, Gong B,. Effective components and molecular mechanism of agarwood essential oil inhalation and the sedative and hypnotic effects based on GC-MS-qtof and molecular docking [J]., 2022, 27(11): 3483.

[12] Wang S, Wang C H, Peng D Q,. Agarwood essential oil displays sedative-hypnotic effects through the GABAergic system [J]., 2017, 22(12): 2190.

[13] Wang S, Wang C H, Yu Z X,. Agarwood essential oil ameliorates restrain stress-induced anxiety and depression by inhibiting HPA axis hyperactivity [J]., 2018, 19(11): 3468.

[14] Chen X Q, Wang C H, He Q Q,. Chemical composition and potential properties in mental illness (anxiety, depression and insomnia) of agarwood essential oil: a review [J]., 2022, 27(14): 4528.

[15] Li W, Chen H Q, Wang H,. Natural products in agarwood andplants: Chemistry, biological activities and biosynthesis [J]., 2021, 38(3): 528-565.

[16] 彭德乾, 王燦紅, 劉洋洋, 等. 沉香的化學(xué)成分及其藥理活性的研究進(jìn)展 [J]. 中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué), 2021, 38(3): 358-365.

[17] Wang S, Yu Z X, Wang C H,. Chemical constituents and pharmacological activity of agarwood andplants [J]., 2018, 23(2): 342.

[18] 馮劍, 侯文成, 陳蘭, 等. 基于《中華人民共和國(guó)藥典》的奇楠種質(zhì)產(chǎn)沉香的質(zhì)量分析與評(píng)價(jià) [J]. 中國(guó)現(xiàn)代中藥, 2022, 24(3): 432-437.

[19] Hou W C, Liu P W, Liu Y Y,. Chi-Nan agarwood germplasms constitute a new chemotype of(Lour.) Spreng [J]., 2022, 187: 115494.

[20] He Q, Hu D B, Zhang L,. Neuroprotective compounds from the resinous heartwood of[J]., 2021, 181: 112554.

[21] Li W, Cai C H, Guo Z K,. Five new eudesmane-type sesquiterpenoids from Chinese agarwood induced by artificial holing [J]., 2015, 100: 44-49.

Two new eudesmane-type sesquiterpenes in “Qi-Nan” agarwood from

CHEN De-li1, MA Guo-xu1, 2, LIU Hui-mei1, WANG Can-hong1, YANG Yun1, LIU Yang-yang1, WEI Jian-he1, 2

1. Hainan Branch Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Haikou 570311, China 2. Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100193, China

To investigate the neuroprotective of active molecules in “Qi-Nan” agarwood from.The compounds were isolated and purified by modern chromatography techniques, such as silica gel column chromatography, and semi-preparative high performance liquid chromatography, and the chemical structures were identified by NMR and MS spectrometry. The neuroprotective effect of these compounds on corticosterone (CORT) induced PC12 cell damage was evaluated.Two eudesmane-type sesquiterpenoids were isolated from the supercritical extract of “Qi-Nan” agarwood, and named as (7,8,10)-(+)-8-hydroxy-selina-4,11-dien-12,15-dial (1) and (7,8,10)-(+)-8,11-dihydroxy- selina-4-en-15-al (2). Compounds 1 and 2 significantly increased the survival rate of PC12 cells after injury.Compounds 1 and 2 are new compounds with the trivial name aquqinanols A and B, which have moderate neuroprotective effects against PC12 cell damage induced by CORT.

Qi-Nan; agarwood;(Lour.) Spreng; eudesmane-type sesquiterpenoids; neuroprotective; aquqinanol A; aquqinanol B

R284.1

A

0253 - 2670(2023)16 - 5137 - 05

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.16.001

2023-03-21

海南省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（ZDYF2020111）；海南省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（ZDYF2022SHFZ030）；中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與健康科技創(chuàng)新工程（2021-I2M-1-032）；國(guó)家自然科學(xué)青年基金項(xiàng)目（82204657）

陳德力，男，博士，副研究員，主要從事天然藥物化學(xué)研究。E-mail: chendeli9999@163.com

劉洋洋，男，研究員，研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量控制技術(shù)及其應(yīng)用。Tel: (0898)31589007 E-mail: eadchris@163.com

魏建和，男，研究員，研究方向?yàn)樗幱弥参锘蛸Y源、分子育種及次生代謝產(chǎn)物調(diào)控。Tel: (010)57833016 E-mail: wjianh@263.net

[責(zé)任編輯 王文倩]