奇楠沉香中2個新的桉烷型倍半萜類化合物

陳德力，馬國需, 2，劉會梅，王燦紅，楊 云，劉洋洋*，魏建和, 2*

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奇楠沉香中2個新的桉烷型倍半萜類化合物

陳德力1，馬國需1, 2，劉會梅1，王燦紅1，楊 云1，劉洋洋1*，魏建和1, 2*

1. 中國醫學科學院 北京協和醫學院藥用植物研究所海南分所，海南 ?？?570311 2. 中國醫學科學院 北京協和醫學院藥用植物研究所，北京 100193

研究奇楠沉香中具有神經細胞損傷保護作用的活性化合物。利用硅膠柱色譜、半制備液相色譜等現代色譜技術進行分離純化，結合核磁共振和質譜等現代譜學手段鑒定其結構，同時體外法測定化合物對皮質酮（corticosterone）誘導PC12細胞損傷的保護作用。從奇楠沉香超臨界提取物中分離得到2個桉烷型倍半萜類化合物，分別鑒定為(7,8,10)-(+)-8-hydroxy-selina-4,11-dien-12,15-dial（1）和(7,8,10)-(+)-8,11-dihydroxy-selina-4-en-15-al（2）；體外對PC12細胞損傷存活率顯著升高。化合物1和2為新化合物，分別命名為奇楠醇A和奇楠醇B，均對皮質酮誘導PC12細胞損傷具有一定的保護作用。

奇楠；沉香；白木香；桉烷型倍半萜；神經保護；奇楠醇A；奇楠醇B

焦慮和抑郁等常見的神經精神性疾病，已成為危害人類健康的第二大疾病，且其病因病機復雜多變，并多伴有嚴重并發癥[1]。沉香為瑞香科（Thymelaeaceae）植物白木香(Lour.) Spreng傷害誘導防御反應形成的含有樹脂的木材，是我國傳統醫學中常用的理氣藥，具有行氣止痛、溫中止嘔、納氣平喘、益氣和神的功效，通過吸入揮發性香氣物質起到鎮靜安神、調節睡眠作用[2-3]?，F代藥理研究表明，沉香提取物或單體化合物具有較好的鎮靜催眠、抗焦慮、抗抑郁和抗神經炎作用[4-9]。課題組前期亦明確沉香揮發性成分或醇提物具有顯著鎮靜促睡眠、抗焦慮和抗抑郁的作用[10-14]。普通沉香的化學成分和藥理作用已有大量研究[15-17]，而奇楠沉香因其獨特的芳香氣味和性狀而區別于普通沉香，被認為是最具有上等品質和珍貴價值的沉香，現已開始批量上市銷售，本課題組研究表明其物種仍為白木香，是一種新的化學型[18-19]，其研究報道較少。因此，從奇楠沉香中挖掘具有神經調控或保護作用的先導活性分子，具有重要的科學研究意義。

課題組為了進一步了解奇楠沉香揮發性成分，并從中挖掘具有神經保護作用的潛在藥物分子，對其超臨界提取物進行了分離純化，采用波譜學技術手段鑒定了2個新化合物，分別鑒定為(7,8,10)- (+)-8-hydroxy-selina-4,11-dien-12,15-dial（1）和(7,8,10)-(+)-8,11-dihydroxy-selina-4-en-15-al（2），均為桉烷型倍半萜類化合物（圖1）。同時，采用體外法評價化合物對皮質酮（corticosterone）誘導PC12細胞損傷的保護作用，發現化合物1和2可保護皮質酮誘導的PC12細胞損傷。

圖1 化合物1和2的結構

1 儀器與材料

Bruker Avance III 600型核磁共振波譜儀（德國布魯克公司），高分辨質譜儀Q-tof（美國沃特世公司），Nicolet iS5 FT-IR型傅里葉紅外光譜儀（美國賽默飛公司），Photophysics Chirascan圓二色譜儀（英國應用光物理公司），MCP200型自動旋光儀（德國安東帕公司）。BS110S型分析天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司），P230型高壓半制備液相色譜儀（大連依利特分析儀器有限公司），DAD230＋二極管陣列大連檢測器（大連依利特分析儀器有限公司），RE-5299型旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠），超聲波清洗儀（深圳市潔盟清洗設備有限公司）。SB-Phenyl色譜柱（250 mm×9.4 mm，5 μm，安捷倫公司），柱色譜用硅膠（100～200目，青島海洋化工有限公司），薄層色譜用硅膠G、H、GF254（青島海洋化工有限公司），水（杭州哇哈哈集團有限公司），石油醚、醋酸乙酯、二氯甲烷、甲醇等常規試劑均為國產分析純。

奇楠沉香CO2超臨界提取物（100.0 g）由瑜豐沉香匯（廣東）科技有限公司提供。奇楠沉香產自廣東茂名，經中國醫學科學院藥用植物研究所海南分所劉洋洋研究員鑒定為奇楠種質沉香(Lour.) Spreng。

2 方法

2.1 提取與分離

奇楠沉香CO2超臨界提取物（100.0 g）總浸膏經100～200目硅膠柱色譜分離，使用石油醚-醋酸乙酯溶劑系統進行梯度洗脫（40∶1、30∶1、20∶1、15∶1、10∶1、8∶1、6∶1、3∶1、1∶1、0∶1），得到Fr. A～J。其中Fr. H部位（石油醚-醋酸乙酯3∶1）經半制備高效液相色譜分離純化得到化合物1（9.8 mg，R＝17.2 min，甲醇-水65∶35，體積流量2.0 mL/min）；Fr. G部位（石油醚-醋酸乙酯6∶1）經半制備高效液相色譜分離純化得到化合物2（2.4 mg，R＝17.7 min，甲醇-水60∶40，體積流量2.0 mL/min）。半制備高效液相檢測波長均為210 nm。

2.2 神經保護活性篩選

體外法測定化合物對皮質酮誘導PC12細胞損傷的保護作用[20]。PC12細胞按常規方法培養，在96孔板中接種對數生長期細胞，使細胞濃度為5×104個/mL，每孔加入100 μL，置于37 ℃含5% CO2的培養箱中培養24 h。設置對照組、模型組、陽性對照地西泮組、實驗組。對照組中加入200 μL不完全培養基不做任何處理；模型組只用200 μL的皮質酮（終濃度為200 μmol/L）處理；實驗組以100 μL的皮質酮（終濃度為200 μmol/L）和相應藥物（50、25、12.5、6.25、3.125、1.562 5 μg/mL）處理，陽性對照組地西泮（地西泮產生毒性的血藥濃度為30 μg/mL，故給藥劑量設其1/10劑量3.125 μg/mL）100 μL處理細胞。置于37 ℃、5% CO2的培養箱中培養 24 h，小心吸取100 μL的含藥培養基，加入CCK8 10 μL，置于37 ℃含5% CO2的培養箱中孵育2 h后，將96孔板置于酶標儀450 nm波長處測定吸光度（）值，計算細胞存活率。

細胞存活率＝(實驗－空白)/(對照－空白)

3 結果與分析

3.1 結構鑒定

表1 化合物1和2的1H-和13C-NMR數據(600/150 MHz, CDCl3)

Table 1 1H- and 13C-NMR data of compounds 1 and 2 (600/150 MHz, CDCl3)

碳位12δHδCδHδC 11.63 (m), 1.42 (m)39.11.62 (m), 1.38 (m)39.0 21.60 (m), 1.42 (m)17.61.60 (m), 1.45 (m)17.6 32.38 (m), 2.06 (d, J = 4.2 Hz)23.82.37 (dd, J = 15.6, 4.8 Hz), 2.00 (d, J = 4.2 Hz)23.9 4 133.7 133.3 5 160.3 161.4 63.34 (dd, J = 8.4, 3.6 Hz), 2.44 (dt, J = 14.4, 2.4 Hz)27.93.37 (dd, J = 14.4, 3.6 Hz), 1.85 (t, J = 3.0 Hz)25.1 72.58 (td, J = 10.2, 3.6 Hz)46.71.60 (m)55.0 84.14 (td, J = 10.8, 4.2 Hz)68.84.20 (td, J = 10.8, 4.2 Hz)68.5 92.04 (d, J = 4.2 Hz), 1.44 (m)50.01.98 (d, J = 4.2 Hz), 1.40 (m)50.0 10 38.3 37.9 11 150.2 75.2 129.61 (s)195.11.33 (s)23.8 136.47 (s), 6.23 (s)136.21.34 (s)30.3 141.27 (s)26.11.21 (s)26.1 1510.11 (s)191.010.17 (s)190.7

圖2 化合物1和2的關鍵1H-1H COSY () 和HMBC () 相關

化合物1的相對構型由NOESY譜圖。在NOESY譜圖中，H-8與H-14/H-9a/H-6a存在相關，表明他們處于同側；H-7與H-9b存在NOE相關，H-7與H-8未觀察到NOE增益，結合兩者的偶合常數（3＞9.0）進一步證明兩者處于反式。為了進一步確定其絕對構型，參考該類化合物的生物合成途徑以及在B3LYP/6-31 G (d) 基組水平的計算ECD圖譜與化合物1的實驗圖譜一致（圖3），確定其絕對構型為7,8,10-1。經文獻檢索，確定該化合物為新化合物，鑒定為(7,8,10)-(+)-8-hydroxy-selina- 4,11-dien-12,15-dial，命名為奇楠醇A。

圖3 化合物1和2的實測和計算ECD譜圖

3.2 活性測試結果

體外測定化合物對皮質酮誘導PC12細胞損傷的保護活性結果表明，皮質酮誘導損傷的PC12細胞存活率為48.8%，與陽性對照藥地西泮相比（皮質酮誘導細胞損傷后的細胞存活率為85.2%），化合物1和2在25.0 μg/mL時，對損傷后的PC12細胞的存活率分別為83.4%、86.2%；在12.5 μg/mL時，化合物1和2對損傷后的PC12細胞的存活率分別為72.4%、76.3%；在6.25 μg/mL時，化合物1和2對損傷后的PC12細胞的存活率分別為57.5%、63.8%；表明化合物1和2對皮質酮誘導損傷的PC12細胞具有一定的保護作用。

4 討論

沉香中含有結構類型豐富的倍半萜類化合物，主要包括桉烷型、艾里莫芬烷型和愈創木烷型等。該研究利用多種現代色譜技術結合譜學手段，從奇楠沉香超臨界提取物中分離并鑒定了2個桉烷型倍半萜類化合物，均為新化合物。同時，體外法測定化合物對CORT誘導PC12細胞損傷的保護作用，發現化合物1和2均具有一定的神經細胞損傷保護活性。綜上，本研究結果豐富了奇楠沉香超臨界提取物的化學成分，為其開發利用提供了參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Two new eudesmane-type sesquiterpenes in “Qi-Nan” agarwood from

CHEN De-li1, MA Guo-xu1, 2, LIU Hui-mei1, WANG Can-hong1, YANG Yun1, LIU Yang-yang1, WEI Jian-he1, 2

1. Hainan Branch Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Haikou 570311, China 2. Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100193, China

To investigate the neuroprotective of active molecules in “Qi-Nan” agarwood from.The compounds were isolated and purified by modern chromatography techniques, such as silica gel column chromatography, and semi-preparative high performance liquid chromatography, and the chemical structures were identified by NMR and MS spectrometry. The neuroprotective effect of these compounds on corticosterone (CORT) induced PC12 cell damage was evaluated.Two eudesmane-type sesquiterpenoids were isolated from the supercritical extract of “Qi-Nan” agarwood, and named as (7,8,10)-(+)-8-hydroxy-selina-4,11-dien-12,15-dial (1) and (7,8,10)-(+)-8,11-dihydroxy- selina-4-en-15-al (2). Compounds 1 and 2 significantly increased the survival rate of PC12 cells after injury.Compounds 1 and 2 are new compounds with the trivial name aquqinanols A and B, which have moderate neuroprotective effects against PC12 cell damage induced by CORT.

Qi-Nan; agarwood;(Lour.) Spreng; eudesmane-type sesquiterpenoids; neuroprotective; aquqinanol A; aquqinanol B

R284.1

A

0253 - 2670(2023)16 - 5137 - 05

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.16.001

2023-03-21

海南省重點研發計劃項目（ZDYF2020111）；海南省重點研發計劃項目（ZDYF2022SHFZ030）；中國醫學科學院醫學與健康科技創新工程（2021-I2M-1-032）；國家自然科學青年基金項目（82204657）

陳德力，男，博士，副研究員，主要從事天然藥物化學研究。E-mail: chendeli9999@163.com

劉洋洋，男，研究員，研究方向為中藥質量控制技術及其應用。Tel: (0898)31589007 E-mail: eadchris@163.com

魏建和，男，研究員，研究方向為藥用植物基因資源、分子育種及次生代謝產物調控。Tel: (010)57833016 E-mail: wjianh@263.net

[責任編輯 王文倩]