全癌標志物：腫瘤免疫治療療效評估的新手段

湯佳林

惡性腫瘤，也就是人們所說的的癌癥，其顯著特征為體內細胞不受控制地持續分裂、增殖和轉移。2020年全球新增癌癥病例約為1930萬例，癌癥相關死亡人數約1000萬，其中中國新增癌癥病例約為457萬例，癌癥死亡人數約300萬[1]。惡性腫瘤發病率和死亡率逐年升高，已成為人類面臨的全球性的公共衛生挑戰。

腫瘤免疫治療及其療效評估現狀

傳統腫瘤治療方法包括外科手術、放射治療、化學藥物治療等，但這些方法都存在一定的缺陷，如：外科手術風險高、創傷大，且術后可能產生一系列并發癥，影響預后和后期治療；放射治療過程中，隨著累積劑量的增加，當超過正常組織的耐受劑量時，會導致機體功能紊亂失調，皮膚瘙癢糜爛等放射損傷，影響組織正常功能；傳統的化學藥物治療，因其對正常細胞生長增殖的影響會引起惡心嘔吐、感染、脫發等不良反應。因此，研究人員越來越多地將目光投注在免疫治療領域。

免疫治療已有100多年的歷史，早在19世紀末，科利（W. Coley）就采用混合的細菌毒素（也稱為科利毒素）來治療惡性腫瘤，這是腫瘤免疫治療的起步。但是直到近十年，免疫治療才逐漸走入大眾視野，并受到世界腫瘤學界的廣泛認可。2013年《科學》（Science）雜志評出的年度十大科學突破排行榜中，免疫治療高居榜首，成為了癌癥免疫療法歷史上的里程碑事件。近年來，隨著腫瘤學、免疫學、分子生物學、生物工程等學科的發展，腫瘤免疫治療已成為繼手術和放、化療之后腫瘤治療的新模式。免疫治療是國內外腫瘤治療研究領域的熱點之一，大量臨床研究均顯示出令人振奮的成果。免疫檢查點抑制劑（ICIs）包括程序性細胞死亡1（PD-1）抑制劑、程序性細胞死亡1配體1（PD-L1）抑制劑和細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4（CTLA-4）抑制劑已經徹底改變了癌癥治療，并在過去幾年中成為多種惡性腫瘤的標準治療方法，為晚期黑色素瘤和非小細胞肺癌、膀胱癌等實體瘤患者帶來了福音[2，3]。

腫瘤免疫治療的出現，顯著提高了腫瘤患者的生存質量，然而，如何選擇有效的免疫治療藥物卻成了醫生和患者的一個難題。不同類型的藥物，治療反應不盡相同，原本基于影像學為主的療效評估手段已經無法適應抗腫瘤藥物日新月異的變化，急需有效的動態評估抗腫瘤治療的措施。1979年，世界衛生組織（WHO）定義了腫瘤療效評估的方法，該標準明確了實體瘤雙徑測量的療效評價標準，即測量所有腫瘤的最大平面范圍并將所有值相加，比較兩次檢查間的所有腫瘤平面最大值之和。1985年，相關研究發現臨床試驗療效評價的偏倚有5%～10%，是因為WHO標準對有些病灶的定義模糊和腫瘤測量上的誤差造成的，這顯然會降低評估結果的可比性，從而影響結論的可靠性。1999年，研究者提出了以腫瘤最長徑的長度代替面積來代表腫瘤大小的一維測量方法（或稱單徑測量法）[4]，并于2000年發布了RECIST 1.0標準，2009年RECIST標準更新為1.1版本。這些標準雖然在WHO標準的基礎上簡化了測量步驟，提升了準確性，但仍然是根據傳統影像（CT、MR）測量腫瘤大小的變化來判斷療效。實際上，許多腫瘤治療后在體積上的變化并不明顯，例如淋巴瘤、肉瘤、肝癌等。因此，用RECIST標準并不能很好反映真實的療效。

2017年，RECIST工作組及其免疫治療小組委員會發表了《實體瘤免疫療效評價標準（iRECIST）》，闡述如何評價免疫治療試驗中的緩解和進展[5]。iRECIST這一新分類是基于近年來腫瘤免疫治療臨床研究的結果，即使在治療開始時出現一些新發病灶，或總腫瘤負荷未顯著增加，之后仍可能發生腫瘤消退或穩定。這是免疫相較于既往化療和靶向藥物治療的差異之一，也革新了有關免疫治療腫瘤負荷的評價標準。然而，隨著免疫治療時代的到來，出現了很多以前在腫瘤評價方面未曾出現的難題，比如假性進展、新發病灶，這些新出現的現象，是免疫治療本身所帶來的，其本質是機體激活的免疫細胞對腫瘤的一種攻擊反應，它是提示腫瘤治療有效的一種標志。但如果按照iRECIST標準進行判斷，則會判定為腫瘤進展，這樣會對患者下一步的臨床治療帶來一定的影響。

DNA甲基化為什么能作為療效評估的手段

液體活檢是一種便捷、非侵入性的檢測方法，可多次取材、實時反映腫瘤異質性的變化，為腫瘤的個性化診療提供參考依據。腫瘤患者體內的循環游離DNA（circulating free DNA， cfDNA）除正常細胞來源外，還有凋亡腫瘤細胞釋放到血液中的DNA小片段，即循環腫瘤DNA（circulating tumor DNA， ctDNA）。ctDNA是一種微創生物標志物，可以幫助測量多種情況下的疾病狀態，包括治療后為檢測分子殘留疾病而進行的手術或治療（MRD），在監測期間和整個治療過程中能做到動態、實時反應腫瘤的治療變化情況，且樣本容易獲得，無需手術，來自腫瘤細胞的ctDNA存在于患者血液、滑膜液等各種體液中，且血液中的ctDNA能全面反映腫瘤血液負荷情況，能克服腫瘤組織樣本取樣的異質性，并可以重復檢測，持續追蹤腫瘤演變過程。

DNA 不是遺傳信息的全部，DNA 上的一些修飾，比如 DNA 甲基化，也會影響這個基因的表達，如果這個基因正好是癌癥相關基因，那么 DNA甲基化這種修飾可能就有誘發癌癥的風險，故DNA甲基化是癌癥發病和進展過程中基因表達和組織分化的重要表觀遺傳調節因子，過去幾十年里在多種癌癥中得到了深入研究。cfDNA中的甲基化異常是液體活檢樣本中研究最廣泛的標志物之一。目前cfDNA 甲基化作為癌癥檢測生物標志物的效用已經得到了臨床評估，例如 FDA批準的Epi proColon（Epigenomics AG）試劑盒，可以檢測血漿 cfDNA 中的高甲基化SEPT9，專門用于結直腸癌篩查[6]。DNA甲基化與各種惡性腫瘤的發生、發展和死亡密切相關，如胰腺癌、結直腸癌、胃癌、肝癌和乳腺癌等[7，8]。除此之外，探索多種腫瘤的DNA甲基化標志物在研究領域也受到了關注。

DNA甲基化有其特有的優勢。首先，與現有的組織細胞形態學、蛋白檢測及傳統的腫瘤標志物不同，DNA甲基化異常發生于腫瘤發生的更早期，可以更早預測腫瘤。其次，發生甲基化變化的CG位點往往在基因組的同一區域內成簇分布，更容易檢測；同時，腫瘤發生各階段都伴有諸多基因的甲基化變異，潛在標志物數量更多、更靈敏。最后，DNA甲基化更穩定，可以在多種不同的臨床樣本類型中進行檢測，例如血漿樣本、病理切片樣本等。基于DNA甲基化的腫瘤檢測，可應用于腫瘤的超早期篩查、輔助診斷、療效評估、復發監測等覆蓋腫瘤診療的全流程，是目前腫瘤篩查與分子診斷領域最熱門的檢測方法之一，因此，對血液中ctDNA的甲基化檢測可以作為免疫治療療效評估的有效手段。

現有DNA甲基化標志物在療效評估中的不足

DNA甲基化與癌癥發生發展的相關性，為個體化治療方案的選擇和療效評估提供了新思路，展現了良好的應用前景。盡管 DNA 甲基化可用于腫瘤的早期篩查、早期診斷、療效預測、預后判斷等，但是其應用還存在一些挑戰。首先，針對不同的癌癥類型，往往有不同的腫瘤標志物；換而言之，如果我們想要做全身的檢查，需要檢測多個標志物。其次，哪怕對于特定的腫瘤，通常需要多個甲基化標志物的聯合檢測，有時候甚至需要依賴于一些復雜的算法。另外，目前的甲基化檢測主要依賴于焦磷酸測序或高通量測序（NGS），兩者均需要價格昂貴的儀器，這些問題限制了甲基化標志物的現實應用。

目前在臨床上DNA甲基化腫瘤標志物分為兩大類：單癌種標志物和泛癌種標志物，其中比較熱門的是泛癌種標志物。兩者都強調腫瘤的異質性，不同點在于單癌種標志物是指一個腫瘤標志物檢測一個癌種，是“一對一”的關系，而泛癌種標志物是把多個不同腫瘤標志物組合成一個集合，實現多個腫瘤的檢測，是“多對多”的關系。這兩大類DNA甲基化腫瘤標志物在一定程度上改善了惡性腫瘤療效評估的問題，然而，單癌種甲基化檢測的靈敏度和特異性都相對比較高，但一個標志物只能檢測一個癌種，隨著檢測癌種數量的增加，費用也會增加，而泛癌種早篩檢測的靈敏度和特異性會隨著檢測癌種的增加，而不定量降低。

現有DNA甲基化標志物存在較大的局限性，一方面，標志物的特異性不佳，經常讓患者全身檢查了一遍發現是虛驚一場；另一方面，不足以反映所有癌癥類型共有的表觀遺傳特征，癌癥早期篩查漏診率高，即使像Galleri這樣從事腫瘤早篩的公司，它公布的基于NGS技術的泛癌早篩臨床驗證數據顯示，臨床Ⅰ期腫瘤的檢出率只有16.8%，Ⅱ期腫瘤也僅有40.4%。這樣的檢出率非常低，遠遠不能滿足大眾對于腫瘤早檢的需求，因為可能有70%～80%的腫瘤在其早期檢測不出來，這也就意味著這些DNA甲基化標志物在療效評估中發揮的作用是極其有限的。

全癌標志物在療效評估中具有重要的臨床應用潛力

不同腫瘤具有異質性，同樣也具有共性，能否找到不同腫瘤共有的甲基化標志物，從而將它們一網打盡呢？基因甲基化與腫瘤相關，基因組中甲基化的CG位點有大約2800萬，要檢測DNA甲基化的狀態，就必須覆蓋足夠多的CG位點。既往的甲基化檢測方法，比如芯片，只能觀察到1%的甲基化狀態，如同摸象只探其尾。全基因組重亞硫酸鹽甲基化測序（WGBS）是目前DNA甲基化測序的金標準，但其方法存在固有缺陷，對腫瘤細胞DNA中胞嘧啶的覆蓋率只有50%左右，因WGBS通過重亞硫酸鹽處理DNA來構建WGBS文庫，而重亞硫酸鹽易導致DNA片段的斷裂，同時將大量未甲基化的胞嘧啶變成胸腺嘧啶，從而使基因組的復雜度降低，DNA甲基化檢測片段與標準基因組的比對率下降，導致測序結果不準確。

為突破傳統 DNA 甲基化測序方法中比對率低的瓶頸，找到不同癌癥共有的甲基化標志物，全癌標志物研究聯盟經過 8 年的攻關開發了導航定位測序（GPS）方法[9]，借助雙端測序，即測序的一端是基因組原序列，另一端是經過重亞硫酸鹽處理后的表觀序列，徹底解決了匹配率低的問題，找到了在所有癌癥中共有的DNA甲基化標志物，命名其為全癌標志物（universal cancer only marker， UCOM）。 2019 年發表了第一個全癌標志物HIST1H4F [10]；2021年，他們發表了第二個全癌標志物 PCDHGB7 [11]；2022年，該團隊聯合空軍軍醫大學附屬西京醫院等機構，成功鑒定了又一個全癌標志物——高甲基化SIX6 [12]。

全癌標志物可在肺癌、乳腺癌、宮頸癌、子宮內膜癌、尿路上皮癌等疾病的早期檢測、轉移風險預測、輔助手術切沿判斷等多個臨床場景中應用[10-12]，不僅在臨床診斷中有非常好的效果，其在伴隨診斷中也有優秀的表現。目前所有的腫瘤治療方案，無論是化療放療還是免疫治療，如果臨床診療措施能夠殺死腫瘤細胞，腫瘤細胞的DNA就會釋放入血，這時DNA甲基化檢測就會出現峰值，從而有利于療效的判斷。與上海第九人民醫院進行的PD-1治療的療效評估中，研究人員發現全癌標志物不僅能幫助判斷患者適用哪種治療方案，還可以讓患者知道自己用哪個廠家的 PD-1治療效果更好。全癌標志物結合腫瘤的免疫治療療效分析，將為今后腫瘤的精準化治療提供理論依據。

結 語

繼“人類基因組計劃”之后，又一項意義重大的項目“精準醫療”開始啟動，人類步入精準醫療時代，腫瘤治療成為精準醫療的短期目標，隨著精準醫學的大力發展，腫瘤免疫治療也逐漸深入臨床并被廣泛應用，為患者帶來明顯的生存獲益，也為精準醫療飛速發展提供了助力。使用“液體活檢”血漿開發新方法來評估治療反應以及抵抗可能的耐藥性是精準醫療的重點研究內容之一，全癌標志物的發現將DNA甲基化在腫瘤檢測中的應用推進到一個嶄新的階段，在腫瘤免疫治療的療效評估中具有重大的應用潛力。

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關鍵詞：精準醫療 免疫治療 DNA甲基化 全癌標志物 ■