全癌標志物：40年的探索發現之旅

于文強

2023年4月28日，全癌標志物在尿路上皮癌檢測中的應用獲得美國食品和藥物管理局（FDA）突破性醫療器械認證。這是我從2013年首次發現全癌標志物以來最開心的一天，這十年間每當我在不同場合講解全癌標志物時，面對別人疑惑的表情以及各種靈魂拷問，我像一個做錯事的小孩。我清楚地知道發再多的文章，做再多的宣講，不如用全癌標志物解決一個臨床實際問題，用臨床真實鮮活的案例來證明一切！我不再糾結于別人是否相信全癌標志物，我要做的是找到更多的合作者，讓全癌標志物得到更多的應用。回想起全癌標志物的發現和我的探索歷程，不禁感慨萬千：看過去，云卷云舒；看未來，風輕云淡；自古尋常事，談笑一揮間！

時光倒回40年

1983年，我還是陜西鄠縣的一個農家小伙，背著行囊走向心中神往的第四軍醫大學；而在地球的另一邊，腫瘤甲基化研究也緩緩掀開序幕。約翰·霍普金斯大學醫學院的范伯格（A. Feinberg）教授在《自然》（Nature）雜志發表文章，在腫瘤樣本中意外發現了全基因組的DNA低甲基化現象，第一次將DNA甲基化和腫瘤聯系起來，開創了DNA甲基化在腫瘤研究領域的先河[1]。

1984年，約翰·霍普金斯大學的拜林（S. Baylin）教授發現抑癌基因的啟動子區域存在高甲基化現象，并提示該區域的高甲基化是導致抑癌基因在腫瘤中沉默的重要原因。此后，啟動子區域高甲基化理論在腫瘤甲基化研究領域占據主導地位，而范伯格發現的腫瘤存在全基因組DNA低甲基化現象則被束之高閣。全基因組是低甲基化還是局部的高甲基化，到底哪個理論更接近真理？直到1998年，范伯格發表文章，揭示了全基因組DNA低甲基化導致基因組的不穩定，進而參與腫瘤的發生。其實，他們的研究結果都是對的，腫瘤的發生中既存在局部區域的高甲基化，也存在全基因組范圍的低甲基化。科學就是這樣有趣，在百家爭鳴中發展，在百花齊放中進步。

一邊是火焰，一邊是海水

腫瘤DNA甲基化研究已經走過40個年頭，然而DNA甲基化研究和甲基化的應用可以說是冰火兩重天。火焰是指在實驗室或者特定條件下，DNA甲基化檢測能夠獲得很好的檢測效率和漂亮的研究數據，研究者的熱情和信心像火焰一樣；而在臨床應用端，甲基化檢測與臨床的符合率卻比較低，就像澆在頭頂上的一盆盆冰冷的海水。好在DNA甲基化研究領域還有一位標桿性人物，他就是美國南加州大學的瓊斯（P. Jones）教授，他將DNA甲基化酶抑制劑作為藥物用于骨髓增生異常綜合征的臨床治療，取得了不錯的效果。同時，瓊斯也是Septin9的發現者，可以說他的研究成果一定程度緩解了DNA甲基化在腫瘤應用研究方面的尷尬。

千里之行，始于足下

從1983年進入大學，我花了6年時間拿到了醫學本科學位，畢業后留在西京醫院血液科從事臨床工作，主要是白血病的診斷與治療。從1989年到2001年，我的主業是一名臨床醫生，工作期間拿到了碩士和博士學位。可是，已經博士畢業的我常常陷入苦惱，當時的診療手段對血液腫瘤患者常常毫無辦法，只能看著患者的生命逐漸枯萎。我不甘心就這樣束手無策，現有的醫療技術沒有辦法解決問題，我就去探索新的方法！懷著這樣的心情，我以36歲的“高齡”走上了出國留學的道路。

2001年11月，我師從瑞典烏普薩拉大學的奧爾松（R. Ohlsson）教授，就此陰差陽錯地踏入表觀遺傳學領域。彼時還沒多少人知道表觀遺傳學（Epigenetics）。我在瑞典的實驗室從事ChIP-on-Chip [將染色質免疫共沉淀技術（ChIP）及與芯片方法（chip）結合，是一種研究體內DNA與蛋白質相互作用的高通量技術。]的應用研究，用于尋找CTCF（廣泛存在于真核生物中的多功能轉錄因子）的基因結合靶位點。我們成功地將ChIPon-Chip技術用于CTCF靶位點的尋找，之后我們嘗試做MeDIP（methylated DNA immunoprecipitation），就是用甲基化的抗體來富集甲基化區域[2]。

如何更好地將DNA甲基化應用于腫瘤的診斷、治療和預后判斷，成為DNA甲基化研究領域的重要問題。之后，找出其中的關鍵環節就成了我的目標。

時光倒回20年

論如何做一個出色的 “科學殺手”

2003年底，我離開烏普薩拉大學來到約翰·霍普金斯大學范伯格的實驗室做博士后，繼續從事表觀遺傳學研究。作為DNA甲基化研究奠基人的范伯格，招收學生是極其嚴苛的，我在瑞典實驗室相關的研究結果和掌握的實驗技術，為我后續在范伯格的實驗室繼續從事表觀遺傳學研究打下了良好的基礎。

還記得進入實驗室后，第一次和范伯格交流時，他問了我一個問題：一個出色的士兵在戰場上該如何殺死對手？他說你可以用刀，也可以用槍，你可以打傷他的胳膊或大腿，讓敵人流血而死；而一個優秀的士兵應該直擊對手要害，快速致對手于死地。稍后，他又一本正經地告訴我，慢悠悠地殺死對手的方式就讓別人去做吧，我們要做的事情，就是一刀斃命！看到我驚訝的表情，他說你慢慢會懂得做事情的正確方式。我驚訝于他的直截了當，他用一個非常簡單而又非同尋常的方式告訴我，每一個人的時間都是有限的，我們要做科學領域最重要的事情，解決最關鍵的問題。

博觀而約取，厚積而薄發

我在范伯格的實驗室繼續從事DNA甲基化相關的工作。一方面，我想優化經重亞硫酸鹽處理的DNA甲基化檢測方法和方案；另一方面，我希望能夠使用其他化學試劑代替重亞硫酸鹽處理進行DNA甲基化檢測。焦磷酸測序是DNA甲基化定量檢測的金標準，當時焦磷酸測序儀開始被投放用于DNA甲基化檢測，范伯格的實驗室就有一臺在試用，許多DNA甲基化檢測的方案和方法的優化也在這里完成，我們在DNA甲基化檢測領域做了非常多的方法學的優化工作。同時，我也嘗試解決一些腫瘤DNA甲基化領域重要的科學問題。我們發現P15基因區的反義核酸是誘導DNA甲基化最重要的原因，揭示了P15基因的甲基化是如何發生的，以及它在白血病發生過程中是如何被沉默的[3]。我在范伯格實驗室學到的最重要的東西就是先解決問題，再發表文章。如果要解決問題，就要解決最關鍵的科學問題。

時光倒回15年

看似尋常最奇崛，成如容易卻艱辛

2008年初，我回到復旦大學任教，繼續從事表觀遺傳學研究。我以首席科學家的身份領銜了表觀遺傳學領域的第三個973項目“染色質解碼的基礎及醫學應用基礎研究”，著手解決一些DNA甲基化領域的關鍵問題。但是，我發現了一個不容忽視的問題，國外表觀遺傳學領域的研究進展非常快，而國內大多數從本科進入研究生階段的學生，表觀遺傳學的相關理論和實驗技能都非常欠缺。如果我們對表觀遺傳學領域的一個熱點感興趣，等我們深入探究、得出成果起碼得5年以后，到那時這些研究成果可能早就被其他人發表了。所以，我定下規矩，我們實驗室的研究絕不跟著熱點走。我們要么做別人不做的問題，要么將別人做不到的方法、技術進行優化。只有這樣，我們才能超越別人。同時，作為一名臨床醫生出身的科研工作者，我們必須從解決問題入手，解決臨床的問題，解決醫生的問題。

千淘萬漉雖辛苦，吹盡狂沙始到金

2010年，二代測序剛剛興起，我想找一些線粒體DNA甲基化方面的資料，發現居然沒有線粒體DNA甲基化的圖譜。后來我才明白，當時的甲基化檢測技術對于全基因組甲基化位點的覆蓋遠遠不足。人體大約有2800萬個CG位點，常用的450K芯片僅能覆蓋約1%的CG位點。之后出現的全基因組甲基化測序（WGBS），其測序數據的有效利用率也僅在50%左右。為什么WGBS技術會造成如此高比例的數據浪費？因為WGBS技術使用重亞硫酸鹽處理DNA片段，造成基因組的復雜度大幅下降，導致檢測信息丟失。針對重亞硫酸鹽處理導致的比對率降低的技術瓶頸，我們研發了不降低基因組復雜度的全新的全基因組 DNA 甲基化測序技術GPS （guide positioning sequencing），即“導航定位測序”[4]。GPS技術可以覆蓋全基因組96%的胞嘧啶（C），基于該DNA甲基化檢測方案，我們繪制出迄今為止覆蓋率最高的全基因組DNA甲基化圖譜。尤其是在比較正常細胞和腫瘤細胞的甲基化差異位點時，我們可以獲得別人無法捕獲的信息，進而看到別人看不到的東西，破解別人發現不了的規律。

1983年，范伯格在腫瘤樣本中發現了全基因組的DNA低甲基化現象，而GPS測序在30年后以更加精確的技術揭示了腫瘤細胞與正常細胞在全基因組DNA甲基化中的差異。學生開發的測序技術驗證老師30年前的甲基化理論，這是學生對老師的致敬，也是后輩科研工作者站在巨人的肩膀上觸摸星辰。科研總是嚴謹的，有邏輯的，但是這一切好像冥冥之中自有安排，緣分妙不可言。

時光倒回10年

千磨萬擊還堅勁，任爾東西南北風

2013年初，我們突發奇想，想要探索在肝癌細胞中發現的DNA甲基化位點是否可以在其他8種腫瘤細胞中得到驗證。令人驚喜的是，我們發現了一個DNA甲基化位點竟然在8種腫瘤細胞中都呈現高度甲基化狀態。這時，我作為一名臨床醫生的經驗派上了用場，如果這個甲基化標志物在臨床樣本中檢測結果為陰性，至少可以排除這8種腫瘤的可能性。迄今為止，這個甲基化位點已經在25種腫瘤中得到了驗證。至于其他幾種腫瘤，因非常罕見，我們無法找到樣本，并且國際腫瘤數據庫中也沒有相關信息。因此，我們將這些腫瘤共有的甲基化位點命名為“全癌標志物（universal cancer only marker， UCOM）”，意味著它是存在于所有腫瘤中的標志物[5]。

在表觀遺傳學領域，只要存在共同的特征，就會有共同的表觀遺傳學規律。如果我們將腫瘤視為人體的一種另類器官，那么不同類型的腫瘤共享一些甲基化特征就不難理解。我們知道任何事物都有共性和個性，腫瘤也不例外，只是近年來精準醫學的發展讓我們對腫瘤的異質性有了更深刻的認識。但不能因為目前研究異質性的更多，就否認腫瘤共性的存在。我清楚地記得，2019年我們發表第一個全癌標志物時，《癌癥研究》（Cancer Research）雜志的審稿人問了一個尖銳的問題：許多甲基化領域的專家都在尋找腫瘤共有的標志物，為什么其他人都沒找到全癌標志物，而你們找到了呢？我只能回答說，因為我們擁有GPS技術，可以覆蓋全基因組96%的CG位點，能夠看到別人看不到的東西。

蘋果砸在牛頓頭上，牛頓發現了萬有引力定律。然而，萬有引力定律的存在與牛頓的發現無關，萬有引力在牛頓發現之前就存在，在他發現之后仍然存在。全癌標志物也是如此，它的存在是客觀的。實際上，驗證全癌標志物只需要對腫瘤樣本進行雙盲測試。事實勝于雄辯，實踐出真知。

時光倒回5年

路漫漫其修遠兮，吾將上下而求索

作為一名擁有十幾年臨床經驗的醫生，我明白實驗室檢測和臨床應用之間存在巨大的差別。為了全癌標志物能夠在臨床上應用，我們需要建立一種非常穩定的可重復的DNA甲基化檢測方法。然而，正如之前所述，現有的使用重亞硫酸鹽處理來檢測DNA甲基化的方法存在諸多問題。因此，我們必須對該方法進行優化，尤其是去除重亞硫酸鹽處理這一步驟。qPCR通常用于基因表達的定量檢測，該方法簡單、方便、成本低廉，是進行DNA甲基化檢測的最佳選擇。但是，在國際上還沒有人嘗試使用qPCR進行不經過重亞硫酸鹽處理的甲基化定量檢測。從2018年開始，我們用了4年的時間來優化甲基化檢測方法，并將其稱為Me-qPCR（methylation quantitative PCR）技術。該技術能夠定量檢測DNA甲基化，實現DNA甲基化檢測的標準化、流程化和自動化。

目前，全癌標志物研究聯盟已經完成了8萬多例臨床樣本的甲基化雙盲檢測，驗證了基于全癌標志物的Me-qPCR技術在DNA甲基化檢測方面的巨大優勢。在大量臨床樣本的檢測和驗證中，我們逐漸發現全癌標志物的一些特點。第一，全癌標志物具有“全”或“無”的特點，即正常組織中無全癌標志物甲基化異常，而在腫瘤組織中存在該標志物的高甲基化。切莫小看這個特點，正常組織不會出現全癌標志物甲基化異常，所以當患者樣本中檢測到全癌標志物異常，就認為該樣本中存在惡性細胞。第二，全癌標志物是一個惡性腫瘤標志物。這一點非常重要，許多傳統的腫瘤標志物并非專屬于惡性腫瘤細胞，它們的檢出率易受機體其他因素影響。第三，全癌標志物異常早于病理細胞形態學變化，這代表著全癌標志物能在“前癌”階段檢測腫瘤。盡管目前國際上還沒有公認的腫瘤超早期標志物，但我認為全癌標志物具備這樣的潛力，可以實現腫瘤的超早期診斷。如果將全癌標志物應用于腫瘤的早期檢測，并制定有效的篩查方案，我們可以在腫瘤發展初期將其扼殺在萌芽階段，最終實現讓每個人遠離癌癥的目標。

時光倒回1年

莫愁前路無知己，天下誰人不識君

2022年，我們公布了第三個全癌標志物——SIX6基因[6]。從表觀遺傳學的角度出發，我們賦予全癌標志物更多的特點。例如，全癌標志物所在的基因通常在正常和腫瘤組織中都不表達。而且，這些基因大部分在文獻中很少與腫瘤相關聯，這表明全癌標志物在腫瘤發病機制方面與現有理論存在差異。我敢大膽推測，全癌標志物背后隱藏著一種全新的腫瘤發病機制，超越了我們目前腫瘤發病機制研究的范疇。

此外，全癌標志物的相關概念、特征和理念已經獲得越來越多人的認可，并且我們已經與更多醫院和醫生展開了合作。第三個全癌標志物的發現讓更多人認識到在婦科腫瘤以外的其他腫瘤中，全癌標志物也具有優異的檢測效能。全癌標志物已經成功應用于宮頸癌、子宮內膜癌和尿路上皮癌等腫瘤的臨床檢測，并且我們已經與超過50家醫院以及100多位知名臨床專家展開了合作。相信不久的將來，全癌標志物會成為研究領域的熱門話題。

時光倒回半年

獨立千秋萬古存，創造傳世顯英雄

2022年11月到12月期間，全癌標志物研究聯盟參加了由科技部舉辦的全國顛覆性創新大賽，大賽共有2800個項目參與，涵蓋了各個高新技術領域，包括半導體芯片、智能制造和生物醫藥等。該比賽要求創新項目必須具備改變游戲規則的特質。2022年11月23日，在蘇州高新區進行的第一輪答辯中，全癌標志物以五票全通過的成績順利晉級復賽。2023年2月24日，在杭州舉行的總決賽中，全癌標志物獲得了最高獎項——優勝獎，在所有參賽項目中，獲得優勝獎的概率不到2%，全癌標志物也是整個大賽中體外診斷（IVD）領域唯一的優勝獎。在顛覆性創新大賽的總結發言中，我說：“有人說，這世界上本沒有路，走的人多了，就成了路。”事實上，走一條別人未曾走過的道路是相當艱辛的，我們需要克服各種困難，付出超出常人的努力。但不論別人相信與否，我們的目標是將解決問題置于首位。我們要與更多的人合作，將全癌標志物推廣至全國乃至全世界，為大眾和社會提供服務。

當前，卡脖子技術成了熱議的話題，而我們現在解決“卡脖子”問題的方法是破解他人的卡脖子技術。然而，當我們破解他人的技術時，別人并沒有停下腳步，反而研發出更多的卡脖子技術。那我們何時才能超越呢？我認為，最好的破解卡脖子技術的方法是我們也擁有“卡住別人脖子”的技術。只有做到技術反制，我們才能真正挺直腰桿，不再被他人卡脖子。

時光倒回3個月前

風正海闊千帆競，百尺竿頭再攀登

2023年4月28日，一個重要的時刻。基于全癌標志物的尿路上皮癌檢測試劑盒獲得了美國FDA突破性醫療器械認證。對于全癌標志物來說，這是獲得國際認可的第一步。我們堅信，憑借全癌標志物獨有的卓越性能以及我們自主研發的檢測方案和方法，必將實現全癌標志物的廣泛應用。真正的黃金總會閃耀光芒，而真金從不懼火煉。我們將以更新的技術和方案，實現腫瘤的早期診斷、療效評估和預后判斷的全流程監測。我們有信心，將腫瘤診療推向新的階段，讓我們的人民不再為癌癥而心生恐懼！

陜西有一句俗語，叫做“豬沒了，樓上找”，本意是形容一些不會做事的傻瓜。我們做研究的，應該勇于干一些“傻事”。換句話說，如果你按照別人的思路行事，你是無法解決顛覆性問題的。解決問題的關鍵是采用超常規思維、非常規技術，只有這樣，我們才能真正超越自己。

展望未來

我們已經成立了全癌標志物研究聯盟，希望更多的臨床醫生和基礎研究者加入研究聯盟，將全癌標志物應用于不同腫瘤的診斷、治療和預后判斷。此外，全癌標志物參與腫瘤發生的分子機制也是重要的科學問題，當我們弄清楚所有腫瘤的發病機制時，也許能夠為腫瘤找到全新的治療方法和策略。而在未來十年，我們的目標是讓更多國家和人民因全癌標志物的應用而獲益，并為他們的生活帶來新的機遇。全癌標志物，大有可為，未來可期！

[1]Feinberg AP， Vogelstein B. Hypomethylation distinguishes genes of some human cancers from their normal counterparts. Nature， 1983， 301： 89-92.

[2]Yu W， Ginjala V， Pant V， et al. Poly（ADP-ribosyl）ation regulates CTCF-dependent chromatin insulation. Nature Genetics， 2004， 36（10）： 1105-1110.

[3]Yu W， Gius D， Onyango P， et al. Epigenetic silencing of tumour suppressor gene P15 by its antisense RNA. Nature， 2008， 451： 202-206.

[4]Li J， Li Y， Li W， et al. Guide positioning sequencing identifies aberrant DNA methylation patterns that alter cell identity and tumor-immune surveillance networks. Genome Res， 2019， 29： 270-280.

[5]Dong S， Li W， Wang L， et al. Histone-related genes are hypermethylated in lung cancer and hypermethylated HIST1H4F could serve as a pan-cancer biomarker. Cancer Res， 2019， 79： 6101-6112.

[6]Dong S， Yang Z， Xu P， et al. Mutually exclusive epigenetic modification on SIX6 with hypermethylation for precancerous stage and metastasis emergence tracing. Signal Transduction and Targeted Therapy， 2022， 7： 208.

關鍵詞：腫瘤 全癌標志物 DNA甲基化 導向定位測序 ■