野生動物籠舍環境中大腸埃希氏菌對抗生素和消毒劑的抗性分析

劉 青，郭 玲，仉 偉，趙國策，朱云蕓，尹占龍，謝緒昌

（1.濟南市公園發展服務中心（動物園工作部），濟南，250031；2.北京動物園管理處，北京，100044）

動物籠舍環境中存在多種來自外界入侵或者內環境繁殖的細菌，不僅污染動物的生活環境，對動物健康產生潛在的威脅，還可能釋放到籠舍外部，通過傳播對周圍環境產生影響，這一過程也成為耐藥菌株在不同動物及不同生態系統間傳遞的重要途徑。因此，做好動物飼養環境衛生、消毒等生物安全措施至關重要。消毒劑作為控制微生物感染和傳播的重要方式被廣泛應用［1］，然而消毒劑的長期不合理使用，也會使細菌產生耐藥性從而降低殺菌效果［2］，抗生素和消毒劑之間的交叉耐藥性也成為一個被廣泛關注的問題［3］。

大腸埃希氏菌（Escherichia coli）廣泛存在于動物籠舍的地面、墻面及棲架等處，是流行病學調查和研究的重要指示菌。本研究從4 種野生動物籠舍（猛獸館、大象館、猿猴館和鳴禽館）環境中分離大腸埃希氏菌作為受試菌，測定受試菌對常用7 種抗生素的敏感性和4 種消毒劑的最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC），并對菌株攜帶的抗性基因進行篩選，以期為圈養野生動物抗生素、消毒劑的使用提供數據支持，為野生動物耐藥性來源的探析提供參考，對改善籠舍環境衛生、保障動物健康及維護公共衛生安全具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 細菌的分離鑒定

2022 年4—7 月，對濟南動物園大象館、猛獸館、鳴禽館和猿猴館4 個館舍內的環境樣本進行采樣，用無菌棉簽擦拭籠舍墻壁、棲架和水槽等處，放入含PBS 的1.5 mL EP 管中帶回實驗室，調整濃度涂布在大腸桿菌顯色培養基（ECC）上，37 ℃恒溫培養18～24 h，挑取藍綠色單菌落純化，提取細菌基因組DNA 送至北京賽默百合生物科技有限公司測序分析。

1.2 抗生素藥敏試驗

根據美國臨床和實驗室標準協會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）推薦的紙片擴散法檢測分離菌株對臨床常用7 種抗生素的敏感性，結果按照CLSI的標準判定（表1）。

表1 大腸埃希氏菌抑菌圈直徑折點Tab.1 Diameter break point of inhibition zone of Escherichia coli

1.3 消毒劑最低抑菌濃度測定

參照CLSI 2017和Zou等［4］推薦的微量肉湯稀釋法，測定過硫酸氫鉀復合粉、二氯異氰尿酸鈉粉、過氧乙酸溶液和戊二醛癸甲溴銨溶液4 種消毒劑對分離菌株的MIC。將篩選出的菌株制備成菌懸液加入到96 孔板中，并將消毒劑進行梯度稀釋，最高濃度為1∶50，最低濃度為1∶25 600，每個樣本重復測定 3次，以抑制細菌生長的最高稀釋度作為測試消毒劑的MIC。

1.4 抗性基因篩選

利用Illumina 測序平臺完成樣品的基因組二代建庫及測序，將服務器里的數據上傳至集群并運行序列拼接，獲得菌株抗性基因等信息。

2 結果

2.1 大腸埃希氏菌的分離鑒定

大腸埃希氏菌在ECC 培養基中形成邊緣整齊、藍綠色的光滑菌落，直徑1～2 mm。將通過特異性培養基篩選出的菌株純化后提取細菌基因組DNA，經16S rRNA 通用引物進行PCR 擴增，結果顯示，在1 400 bp 處有明亮的目的條帶（圖1）。PCR 產物測序后與GenBank 中的大腸埃希氏菌序列進行比對分析，若同源性達到99%以上，則判定菌株為大腸 埃希氏菌。通過鑒定，每個館舍分別篩選出10 株 大腸埃希氏菌，共計40 株進行后續檢測，其中空氣中分離3 株（7.5%），墻壁隔離網8 株（20.0%）、棲架臥床11 株（27.5）、地面15 株（37.5%）和水槽食盆 3株（7.5%）。

圖1 大腸埃希氏菌16S rRNA PCR鑒定結果Fig.1 PCR identification result of 16S rRNA of Escherichia coli

2.2 藥敏試驗結果

40 株大腸埃希氏菌的耐藥表型見表2。分離菌株對復方新諾明和氨芐西林的耐藥率較高，分別為50.0%和40.0%，其次為頭孢噻肟7.5%，諾氟沙星和慶大霉素的耐藥率均為5.0%，對美羅培南敏感。菌株的主要耐藥譜型為氨芐西林加復方新諾明。大象館環境中菌株耐藥范圍最廣，對4 種藥物表現出耐藥性，其次是猛獸館和猿猴館，鳴禽館僅對2 種藥物表現出耐藥性。猛獸館菌株對氨芐西林、復方新諾明和頭孢噻肟的耐藥率均最高，分別為70%、70%和30%。

表2 不同館舍環境中大腸埃希氏菌耐藥率Tab.2 Drug resistance rate of Escherichia coli at different cages

2.3 消毒劑最低抑菌濃度

4 種消毒劑對不同館舍大腸埃希氏菌的MIC 值分布情況見表3。分離菌株對過氧乙酸較敏感，MIC 值為1∶1 600～1∶6 400，低于推薦使用濃度（1∶1 000）；過硫酸氫鉀復合粉MIC 值為1∶400～ 1∶1 600，等于或低于推薦使用濃度（1∶400）；二氯異氰尿酸鈉粉廠家推薦使用的濃度范圍較大，35.0%的菌株MIC值達到1∶800，高于推薦的最低使用濃度（1∶2 000），60%的菌株MIC 值為1∶1 600，均低于推薦的最高使用濃度（1∶200）；戊二醛癸甲溴銨溶液MIC 值為1∶1 600～1∶6 400，其中17.5%的菌株MIC值為1∶1 600，接近推薦使用的最高濃度（1∶2 000）。鳴禽館菌株對消毒劑的敏感性高于其他館舍，二氯異氰尿酸鈉粉、過硫酸氫鉀復合粉和戊二醛癸甲溴銨溶液的最高MIC 值均低于大象館、猛獸館和猿猴館。

表3 消毒劑MIC值分布情況Tab.3 MIC value distribution of disinfectant

2.4 抗性基因檢測結果

抗性基因篩選結果顯示，40 株大腸埃希氏菌共檢測到29 種耐藥基因，其中抗生素耐藥基因有β-內酰胺類（blaTEM、blaCTX、blaACT、blaCMY和blaDHA）、喹諾酮類（qnrB、qnrS）、氨基糖苷類（aadA、aph、aac）、四環素類（tet（A）、tet（D））、磺胺及其增效劑類（sul1、sul2、sul3和dfrA）、氯霉素類（cmlA、floR）、磷霉素（fosA）、利福平（ARR）和大環內酯類（mph（A））；消毒劑抗性基因篩選出sugE、emrE、qacE、qacEΔ1、qacF、qacH和qacI；還有多藥排外泵mdfA（圖2）。所有菌株都攜帶至少1 種抗性基因，猛獸館分離菌株攜帶的抗性基因最多，有28 種，其次是大象館和猿猴館，分別有19、11種抗性基因，鳴禽館分離菌株攜帶的抗性基因最少，僅檢測到5 種。所有抗性基因中mdfA的檢出率最高，為92.5%，其次是tet（A）（45.0%）和sugE（42.5%）。猛獸館分離菌株有90.0%攜帶消毒劑抗性基因，其他3 個館舍消毒劑抗性基因攜帶率為40.0%～50.0%。

圖2 不同館舍環境中大腸埃希氏菌抗性基因篩選結果Fig.2 Resistance gene screening of Escherichia coli at different cages

3 討論

圈養野生動物存在不同程度的耐藥性，Zhu等［5］對我國13 家動物園50 種圈養非人靈長類動物中獲得的995 種大腸埃希氏菌的耐藥性進行調查，結果顯示83.62%的菌株對至少一種抗生素具有耐藥性，多重耐藥性占47.94%；陸曉健等［6］從動物園中分離出69 株大腸埃希氏菌，發現大腸埃希氏菌對頭孢唑林、四環素和復方新諾明的耐藥率分別為41.42%、61.13%和48.28%；薛原等［7］對東北虎（Panthera tigris altaica）源大腸埃希氏菌的耐藥性進行檢測，發現大腸埃希氏菌對氨芐西林、四環素和復方新諾明的耐藥率高達100.00%、85.12%和80.24%。抗菌藥物的不合理使用是細菌耐藥性產生的重要原因，圈養野生動物管理單位對抗菌藥物的管理和使用存在差異，這些情況未見相關統計報告。在樣本采集單位抗菌藥物的使用主要是針對個體動物的抗感染治療，部分用于小群體細菌性疾病的預防，沒有作為促生長劑添加使用，因此推測圈養野生動物細菌耐藥菌的產生還存在其他相關因素。Mao 等［8］對北京市環境空氣中可培養細菌的細菌組成和耐藥性進行研究，表明環境空氣中大約1/4的細菌都是多重耐藥菌，并指出這可能成為細菌間抗生素耐藥性轉移的潛在途徑。本研究中，從圈養野生動物館舍環境中分離的菌株對復方新諾明和氨芐西林的耐藥率最高，分別為50.0%和40.0%，有研究人員從同一環境下的野生動物糞便中分離大腸埃希氏菌，并對其耐藥率進行檢測分析，發現耐藥率最高的是磺胺類，為41.1%，其次是β-內酰胺類，為31.8%［9］，這提示耐藥細菌的環境傳播與圈養野生動物細菌耐藥性之間存在潛在的相關性，動物的飼養環境可能對圈養野生動物耐藥性的產生和發展具有很大的影響，因此開展圈養野生動物環境菌株相關監測工作是十分必要的。

細菌耐藥性產生的遺傳學機制分為染色體介導和質粒介導耐藥性。染色體介導耐藥性是基因突變產生的［10］，也叫作固有耐藥性，可遺傳且較為穩定；質粒介導耐藥性即獲得性耐藥性，是細菌產生耐藥性的主要機制。對現代環境細菌菌群的基因組學研究顯示，各種環境下存在大量的抗生素耐藥基因［11］，本研究中篩選出了29 種耐藥基因，攜帶率較高的是mdfA及四環素類、磺胺類和β-內酰胺類。

耐藥基因mdfA屬于主要協同轉運蛋白超家族（MFS）成員，不會產生高水平的耐藥［12］，但在過量表達時可能會引起多重耐藥［13］，該基因在生物化學方面有廣泛的研究，但臨床相關性還缺乏佐證，與本研究結果相同的是從美國零售肉中分離的大腸埃希氏菌也有較高的攜帶率（96.5%）［4］。四環素類藥物近5 年在本研究園區沒有使用記錄，因此未做藥敏試驗。本研究中有19 株菌株攜帶tet基因，并在4 個館舍均有檢出，該基因在環境中廣泛分布，推測與其傳播方式密切相關，因為大多數tet基因都與結合或移動元素相連，可以在細菌種間或屬間轉移。目前發現的磺胺類耐藥基因主要有sul1、sul2和sul3［14］，dfrA是編碼甲氧芐啶耐藥二氫葉酸還原酶的抗性基因，在革蘭氏陰性菌中已知有30 多種［15］，是引起磺胺及其增效劑耐藥的主要因素。超廣譜內酰胺酶是革蘭陰性細菌對β-內酰胺類抗生素耐藥的主要機制，可以滅活青霉素、窄譜和廣譜頭孢菌素等。近年來，臨床分離得到的細菌主要攜帶blaTEM和blaCTX等，在大腸埃希氏菌和肺炎菌中發現的較多，其中blaTEM型檢出率總體較高，并具有諸多亞型［16］，該類基因型在本研究園區環境菌株中攜帶率同樣較高。值得注意的是，檢測到5 株頭孢菌素酶耐藥菌株，其中猛獸館 4 株（blaCMY2 株，blaDHA2 株），大象館1 株（blaACT）。頭孢菌素酶是革蘭氏陰性菌對頭孢三代抗生素產生耐藥的重要機制，應該引起重視。

消毒是控制感染的一項重要環節，可有效阻斷病原微生物的傳播，這是做好生物安全，預防疾病的關鍵。但長期使用亞致死濃度的消毒劑易導致細菌對該濃度的消毒劑產生適應效應，逐漸產生染色體或質粒的變異，最終獲得遺傳物質編碼的耐藥性并穩定遺傳，表現出對消毒劑的抗性。近年來，有學者發現一些菌株對消毒劑的敏感性降低［17］，同時還發現一些與消毒劑相關的抗性基因，如位于質粒上的QAC基因家族，可以通過結合轉移傳遞耐藥性，是消毒劑抗性基因研究中最常見的基因［18］，包括qacE、qacEΔ1、qacF、qacG、qacH、qacI和sugE（p）等［19］，染色體編碼基因sugE（c）、emrE、ydgE和ydgF等也特異地介導對QAC 的抗藥性，并可在大腸埃希氏菌中垂直傳播。本研究園區季銨鹽類消毒劑沒有在環境消毒中廣泛使用，但在各館舍的分離菌株中共檢測到 7種相關耐藥基因，來源有待進一步研究。消毒劑的規范使用至關重要，本研究中消毒劑的MIC 檢測結果可作為參考，在實際應用過程中會受有機物、溫度和污染物等多種因素的影響［20-21］，因此需要根據實際情況調整使用濃度，以達到較好的消毒效果。