圈養黃頰長臂猿糞便皮質醇代謝分析

楊 波 ，屈元元 ，桓宗錦，趙 波，張松蘭，董 禮，李登翯，朗舜筠，羅 波，李德生，鐘 義，黃 炎

（1.中國大熊貓保護研究中心，大熊貓國家公園珍稀動物保護生物學國家林業和草原局重點實驗室，邛崍山、岷山瀕危野生動植物保護生物學國家長期科研基地，成都，610081；2.成都動物園（成都市野生動物研究所），成都，610081；3.中國野生動物保護協會，北京，100010）

黃頰長臂猿（Nomascus gabriellae）被IUCN 列為瀕危（EN）物種，分布于越南南部、老撾南部、柬埔寨東部的熱帶、亞熱帶常綠闊葉林區域［1-2］。我國曾引入人工飼養，截至2016 年底圈養種群數量為89 只［3］。圈養野生動物由于受到生存空間限制、人為干擾（展覽、施工、科研）和單一飼養模式等因素的長期影響，正常行為的表達受到干擾而易產生刻板行為，進而導致繁殖率和動物福利降低［4-5］。皮質醇（cortisol，CORT）屬于一種糖皮質激素，參與糖類、脂肪和蛋白質的代謝，也常用來專指“應激激素”。皮質醇逐漸成為衡量機體產生應激效應的指標，被廣泛應用于野生動物生存壓力分析與環境豐容評估［6-7］。目前非人靈長類動物皮質醇研究主要集中在恒河猴（Macaca mulatta）［8］、黑猩猩（Pan troglodytes）［9］、滇金絲猴（Rhinopithecus bieti）［10］、黃山短尾猴（Macaca thibetana）［11］和川金絲猴（Rhinopithecus roxellana）［7，12］等，黃頰長臂猿皮質醇代謝的相關研究未見報道。本研究通過追蹤測定1 對圈養黃頰長臂猿的糞便皮質醇水平，分析皮質醇代謝與游客干擾、季節和動物發情等因素的關系，以期為黃頰長臂猿圈養種群飼養與繁育管理提供一定的參考。

1 研究對象與飼養環境

試驗對象來源于成都動物園（1 雄1 雌），雄性呼名為“Pete”，雌性呼名為“Vivi”，基本信息見表1。每日08：00和15：00投食，食物主要為香蕉、蘋果、梨和葡萄等水果以及長臂猿窩窩頭、雞蛋和小葉女貞（Ligustrum quihoui）葉（自由采食）等。試驗期間，研究對象采食良好，身體健康。

表1 試驗對象基本信息Tab.1 Basic information of experimental subjects

飼養環境由室內展廳和室外展廳組成。內展廳呈五邊形，兩面玻璃、兩面水泥，另有一面為鐵門，面積約40 m2，高約5 m。廳內設有供暖系統（冬季控溫10～15 ℃），還有平臺、繩梯和棲架等；室外展廳為不規則多邊形，兩面為玻璃，頂部為鐵絲網，其余面為水泥，總面積約60 m2，高約6 m。廳內有繩梯、平臺、棲架和輪胎等，還種植有小葉女貞、南天竹（Nandina domestica）和花葉艷山姜（Alpinia zerumbet‘Variegata’）等。

2 研究方法

2.1 樣品采集與處理

2016 年4 月—2017 年4 月，每日08：00—11：30收集糞便樣品，每1～3 d 采樣1 次。共收集雌性糞樣199 份，雄性糞樣166 份。利用一次性PE 手套采樣后裝入自封袋，并記錄供者名稱與采樣時間，1 h 內置于-20 ℃凍存。采用凍干研篩法預處理糞樣（凍干機型號為Telstar LyoQuest-55），糞便粉末置于-75 ℃凍存。

2.2 激素提取與測定

激素提取與測定參考唐丹等［13］的方法，利用90%乙醇溶液萃取糞便激素，并采用酶聯免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）測定糞便提取液中皮質醇和雌激素（estrone-3-glucuronide，E1G）水平。

2.3 數據處理與統計

ELISA精確度：批內變異系數（Cv）≤5%，批間變異系數（Cv）≤10%。利用SPSS 22.0 進行數據處理與分析，采用one sample Kolmogorov-Smirnov test進行正態分布檢驗。均不符合正態分布，故采用非參數檢驗（nonparametric tests Mann-WhitneyU）進行差異性分析。皮質醇與雌激素的相關性利用Pearson法分析（雙尾檢驗）。統計結果以平均值±標準差（mean±SD）表示，顯著性水平設α=0.05，極顯著性水平設α=0.01。

3 結果

3.1 假期對皮質醇的影響

統計發現（圖1），雌性Vivi在節假日（包括國家法定節假日和公休日）糞便皮質醇為（146.9±118.1）ng/g（n=64），非節假日皮質醇為（127.0±123.3）ng/g（n=135），兩者無顯著差異性（Z=-1.872，p=0.061）；雄性Pete 在節假日皮質醇為（89.9±75.7）ng/g（n=54），非節假日皮質醇為（117.1±111.6）ng/g（n=112），兩者也無顯著差異性（Z=-1.903，p=0.057）。雖然雌雄之間皮質醇在非節假日無明顯差異（Z=-1.031，p=0.302），但在節假日存在顯著的性別差異，雌性皮質醇水平明顯高于雄性（Z=-3.749，p＜0.001）。

圖1 假期與個體皮質醇水平的關系Fig.1 The relationship between vacation and individual cortisol levels

3.2 皮質醇的季節性變化

按氣象劃分法對季節進行劃分，春季為3—5月，夏季為6—8 月，秋季9—11 月，冬季12—2 月，黃頰長臂猿皮質醇代謝隨季節變化情況如圖2 所示。雌性冬季皮質醇水平［（219.4±140.4）ng/g，n=31］明顯高于春季［（117.9±82.6）ng/g，n=60，Z=-3.637，p＜0.001］、夏季［（92.5±48.1）ng/g，n=54，Z=-4.655，p＜0.001］、秋季［（103.8±53.9）ng/g，n=48，Z=-4.230，p＜0.001］，其他季節間無顯著差異（Z≥-1.351，p≥0.177）；雄性冬季皮質醇［（196.4±194.2）ng/g，n=30］明顯高于春季［（85.7±62.2）ng/g，n=45，Z=-2.796，p=0.005］、夏季［（84.8±28.7）ng/g，n=42，Z=-2.557，p=0.011］、秋季［（88.6±69.3）ng/g，n=55，Z=-2.773，p=0.006］，其他季節間無顯著差異（Z≥-1.818，p≥0.069）；此外，處于同一季節皮質醇水平存在性別差異，春季和秋季雌性皮質醇要明顯高于雄性（Z=-2.273、-2.718，p=0.023、0.007），而夏季和冬季兩者間無顯著差異（Z=-0.262、-1.196，p=0.793、0.232）。

圖2 皮質醇的季節性變化Fig.2 Seasonal variations in cortisol of two individuals

3.3 皮質醇與發情的關系

分析發情期（以Vivi 雌激素E1G 作為發情程度指標）2 只黃頰長臂猿皮質醇水平變化（圖3），共發現8 個完整的發情期。雌性皮質醇隨時間變化趨勢與雌激素相似，兩者呈現顯著正相關（r=0.790，p=0.011）；而雄性皮質醇與雌性雌激素間不存在相關性（r=0.027，p=0.944）。

圖3 發情期雌性與雄性的皮質醇變化Fig.3 Cortisol changes in two individuals during estrus

4 討論

在野生動物遷地保護中，圈養動物的福利一直是熱點研究話題，為此“環境豐容”這一概念得以提出，并且從1982 年開始至今一直被應用于野生動物飼養管理中［14］，如玩具豐容和食物豐容可以有效地增加圈養北白頰長臂猿（Nomascus leucogenys）的日常行為表達包括采食行為與探索行為，并顯著減少對游客的注意力以及減少刻板行為的發生［15-17］。環境豐容還可以顯著減少長期單籠飼養食蟹猴（Ma-caca fascicularis）的異常行為發生［18］，此外還被應用于其他靈長類動物如川金絲猴［7］、黑猩猩［9］和北豚尾猴（Macaca leonina）［19］等種類，成效顯著。本研究發現黃頰長臂猿在節假日的皮質醇水平與非節假日并未呈現出顯著性差異，一定程度上反映出游客干擾（投喂、喊叫、挑逗等）并未對其產生較大的應激影響。究其原因，可能是2 只黃頰長臂猿長期處于動物園展區環境（至少有8 年的經歷），已經對游客干擾產生了一定適應，在其他動物中也發現了類似的適應特性［20］。但有研究發現，長期處于圈養狀態下的大熊貓（Ailuropoda melanoleuca）卻并未產生這種適應，仍對游客產生一定的應激性［21］。李金燕等［22］也報道了在生態旅游開展中游客噪聲會對滇金絲猴產生一定的干擾。這種種間差異反映出動物對應激源的認知受生活經歷、遺傳和行為等因素影響［23］。某些物種在長期處于某種特定環境下可能會對某一個或多個干擾因子產生適應，進而不會將這些外來刺激當作應激源。

黃頰長臂猿皮質醇代謝受季節影響，冬季皮質醇水平明顯高于其他季節（圖2）。一般認為，皮質激素分泌的季節性模式與代謝有關，這種模式被歸因于冬眠期間儲存的脂肪和蛋白質分解代謝的需求，如美國黑熊（Ursus americanus）在冬季和春季皮質醇水平要明顯高于夏季水平［24］；對于不具有冬眠特征的物種如大熊貓也發現了相同的模式，被認為可能是光周期觸發每年一次季節性繁殖模式，行為或生殖需求促進機體維持較高的皮質醇水平［24-25］；小型動物還發現了神經和內分泌因素均導致免疫功能發生季節性改變，冬季皮質醇分泌與免疫功能增強有關［26］。皮質醇季節性變化與動物的能量代謝、免疫、繁育、遺傳和光周期等諸多因素相關，各因素間又受協同作用的影響，因此本研究就該問題很難進行深入考究。考慮到雌性與雄性未有繁育史，由此作簡單推測，黃頰長臂猿季節性分泌模式可能與冬季的嚴寒使得機體分泌皮質醇促進蛋白質、脂肪分解以滿足自身能量需求和增強免疫能力有關。有研究發現，在寒冷的秋冬季節，長臂猿通過減少活動量以及提高采食量、增加采食時間的方式來補充能量損失以減少寒冷帶來的刺激［27］。

本研究還發現發情期的雌性黃頰長臂猿皮質醇變化趨勢與雌激素保持高度一致（圖3），與大熊貓的研究結果［28］一致，表明了腎上腺活動的變化很可能反映了與生殖階段相關的能量需求和發情相關活動水平。不僅如此，在嚙齒類動物身上也發現皮質醇可以增強雌性激素啟動，并促性腺激素分泌和排卵［29］。但雄性黃頰長臂猿并未表現出相似的情況，雄性與雌性未在皮質醇水平上表現出同步性。就此作簡單推斷，雄性在此期間或許并未表現出明顯的性行為（試驗人員與飼養人員也未曾發現），導致這種原因可能與雄性自身繁殖能力、外界干擾有關。Lukas 等［30］研究指出雄性白頰長臂猿對人類產生強烈的依戀性，進一步降低了性熟練程度，或許最終會導致雄性性行為發育不良以至于交配能力的喪失。本研究也發現雄性黃頰長臂猿與白頰長臂猿具有相似的情況，雄性更容易被游客吸引（未做詳細記錄），這在一定程度上也解釋了在節假日雄性皮質醇顯著低于雌性的原因（圖1）。李宏兵等［31］研究發現處于相對安靜繁殖區的白頰長臂猿的社會性行為頻次明顯高于喧鬧的展出區。喧鬧的環境會制約性行為的表現，這或許也是原因之一。本研究鑒于樣本量偏少，存在一定的不確切性，需要今后深入研究，僅為未來相關研究提供參考。鑒于以上結論，建議為參與繁育計劃的黃頰長臂猿提供一個安靜、舒適的飼養環境，減少游客干擾；盡量提供多元化食物，將投喂方式由定時改為不定時，并在秋冬季節適當提供一些高能量的食物；持續開展環境豐容以進一步提高動物福利。