一株野生馬來穿山甲源奇異變形桿菌的分離鑒定及生物學特性分析

劉 根 ，李世宗 ，信愛國，王怡敏，嚴紅亞，常志順，高 洪，李 珂

（1.云南農業大學動物醫學院，昆明，650201；2.云南省畜牧獸醫科學院，昆明，650224；3.云南森林自然中心，昆明，650224）

奇異變形桿菌（Proteus mirabilis）屬腸桿菌科（Enterobacteriaceae）變形桿菌屬，革蘭氏染色為形狀不一、兩端鈍圓的陰性短桿狀、球桿狀，無芽孢和莢膜，有鞭毛及菌毛，能侵襲生長的兼性厭氧菌［1］，是重要的人獸共患條件致病菌。Bisgaard［2］于1981 年首次從患輸卵管炎的產蛋雞中分離到奇異變形桿菌；江益民等［3］于1989 年在我國首次從病死肉雞中分離到奇異變形桿菌。近年來，奇異變形桿菌的分布范圍和寄主譜越來越廣，在食品、土壤、污水和動物的腸道內容物以及臨床標本中均可以檢測到［4］。在家禽鴨［5］，家畜牛［6］、山羊［7］，野生動物眼鏡蛇（Najasp.）［8］、北樹鼩（Tupaia belangeri）［9］、華南虎（Panthera tigris amoyensis）［10］和大熊貓（Ailuropoda melanoleuca）［11］中均有感染案例發生。

馬來穿山甲（Manis javanica）屬于鱗甲目（Pholidota）鯪鯉科（Manidae）鯪鯉屬（Manis）［12］，是全球現存的8種穿山甲之一［13］，IUCN 將其列為極危（CR）物種［14］。本研究旨在查明疑似細菌感染的野生馬來穿山甲發病死亡原因，經臨床剖檢、實驗室診斷和細菌分離鑒定等得到1 株奇異變形桿菌，并開展了分離菌株的生物學特性研究。目前關于野生馬來穿山甲感染奇異變形桿菌的研究鮮有報道，本研究結果可為預防和控制野生馬來穿山甲源奇異變形桿菌感染其他動物提供科學的臨床治療和診斷依據，具有重要的公共衛生學意義。

1 材料與方法

1.1 病料來源及試驗動物

病料取自1 只由野生動物保護協會送檢的不明原因發病死亡的野生馬來穿山甲。成年小白鼠購自昆明醫科大學實驗動物中心。

1.2 分離純化及生長特性

無菌挑取死亡野生馬來穿山甲的肝臟和肺臟組織，三區劃線接種于血瓊脂培養基（購自廣州環凱微生物有限公司），37 ℃恒溫培養24 h，挑取疑似菌落于血瓊脂培養基分離純化。再挑取純化后的單菌落用革蘭氏染液（購自北京索萊寶科技有限公司）染色鏡檢，并劃線接種至麥康凱、SS和LB瓊脂培養基（購自廣州環凱微生物有限公司）上，37 ℃恒溫培養 24 h，觀察菌落形態特征。獲得的純培養物置于50%甘油血清管中-20 ℃保存備用。

1.3 生化試驗

按照腸桿菌科細菌生化常規鑒定盒（購自廣州環凱微生物有限公司）使用說明書，將分離菌株純培養物溶于生理鹽水管中，與5.0 麥氏比濁管進行比濁，再接種至各生化鑒定管中，置于37 ℃恒溫培養規定時間后觀察并讀取結果。

1.4 16S rRNA基因擴增及遺傳進化樹分析

按照細菌基因組DNA 提取試劑盒（購自天根生化科技（北京）有限公司）步驟提取分離菌株的基因組DNA，以其為模板，參照趙鶴庭等［15］方法擴增16S rRNA，擴增引物由捷瑞生物工程（廣州）有限公司合成。產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將含目的條帶的產物及其對應引物送至昆明碩擎生物有限公司雙向測序，測序結果利用SeqMan Ⅱ軟件拼接，將獲得的全長序列與NCBI 數據庫中的參考菌株進行BLAST 同源性比對，利用MEGA 7.0將來自GenBank中的已知參考菌株進行多重序列比對，并采用最大似然法（maximum likelihood method）構建系統進化樹。

1.5 細菌生長曲線

采用酶標儀測量分離菌株的生長曲線。挑取上述純培養物于25 mL LB液體培養基中，37 ℃、200 r/min恒溫搖床培養，每間隔1 h各取300 μL菌液于3個酶標板孔中，測量OD600值。利用GraphPad Prism 軟件以OD600值為縱坐標，時間為橫坐標繪制細菌生長曲線。

1.6 藥敏試驗

選用恩諾沙星、復方新諾明等22 種臨床常用抗菌藥物（購自杭州濱和微生物試劑有限公司），采用K-B 紙片擴散法測量抑菌圈大小，并參照美國臨床和實驗室標準協會（CLSI）制定的藥敏判定標準來判定分離菌株的藥物敏感性［16］。具體操作：挑取純培養物于3 mL 滅菌PBS 中充分混勻，均勻涂布于血瓊脂培養基上，按一定間隔貼上藥敏片，置于37 ℃恒溫培養24 h后進行結果判讀。

1.7 細菌部分耐藥基因檢測

參照文獻［17］報道的細菌5大類15種耐藥基因引物序列（表1）及PCR 擴增條件，進行分離菌株的耐藥基因檢測，引物由捷瑞生物工程（廣州）有限公司合成，產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1 耐藥基因引物序列Tab.1 Primer sequences of drug resistance genes

1.8 毒力基因檢測

參照楊霞等［5］關于奇異變形桿菌部分毒力基因研究的引物序列（表2），引物由捷瑞生物工程（廣州）有限公司合成。PCR 擴增體系為25.0 μL：2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，DNA 模板2.0 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR 擴增條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，退火30 s，溫度見表2，72 ℃延伸45 s，共35 個循環；72 ℃延伸7 min。產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表2 毒力基因引物序列及PCR擴增條件Tab.2 Virulence gene primer sequences and PCR amplification conditions

1.9 小鼠致病性試驗及病理切片觀察

將純化好的分離菌株經LB 液體擴增培養后 洗滌和富集菌體，溶于無菌生理鹽水中。使用分光光度計在OD420下調整菌液濃度，分為8.50×108、1.70×109、3.40×109、6.80×109、1.36×1010cfu/mL 5 個劑量組。每個劑量組對小鼠腹腔注射1 mL 菌液，空白對照組腹腔注射等量LB液體，4只/組，共24只，注射后每組分籠飼養，每隔6 h 觀察記錄小鼠死亡情況，連續觀察1周。

根據改良寇氏法：lgLD50=Xm-i（∑P-0.5）計算分離菌株對小鼠的半數致死量（LD50）［18］，式中Xm為最大劑量組的對數值，i為相鄰兩劑量組對數劑量之差，P為死亡率。對死亡小鼠立即剖檢，無菌挑取肝臟和肺臟組織進行細菌分離鑒定，根據參考文獻［19］報道的奇異變形桿菌OMPA 基因特異性引物（上游引物：5′-CGGAATTCATGAAAAAGACAGC-TATCGC-3′；下游引物：5′-TTGCGGCCGCTTATTGACCAGGTTGAACAAC-3′），通過PCR 進一步驗證是否由該分離菌株導致的小鼠死亡。引物由捷瑞生物工程（廣州）有限公司合成。PCR 擴增體系為25.0 μL：2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，10.0 μmol/L 工作濃度的上、下游引物各1.0 μL，DNA 模板1.0 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR擴增條件：94 ℃預變性7 min；94 ℃變性30 s，61 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35 個循環；72 ℃延伸10 min。產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。分別取試驗組和對照組小鼠肝臟和肺臟組織浸泡在4%多聚甲醛中固定后制備病理組織切片，觀察各組織病理變化情況。

2 結果

2.1 臨床癥狀及剖檢情況

野生馬來穿山甲發病時臨床癥狀為精神萎靡、身體蜷縮和食欲不振；死亡后舌脫離口腔，舌表面有大小不一的潰瘍灶，剖檢可見氣管喉頭處有少量膿性和黏性分泌物，肝臟淤血腫大，呈黑褐色，肺出血且黏膜水腫，其余組織器官未見明顯病變（圖1）。

圖1 野生馬來穿山甲肝臟（A）和肺臟（B）剖檢特征Fig.1 Anatomical characteristics of liver（A）and lung（B）of wild Manis javanica

2.2 細菌分離及形態學特征

分離菌株在麥康凱瓊脂、SS 瓊脂、血瓊脂和LB瓊脂培養基上均生長出圓形、表面光滑、邊緣整齊和形態均一的半透明灰白色單菌落（圖2A-D），生長過程中伴有腐敗臭味。革蘭氏染色鏡檢發現菌體形態為形狀不一的紅色桿狀、短桿狀和球桿狀（圖3）。

圖2 分離菌株形態特征Fig.2 Morphological characteristics of the isolated bacteria

圖3 分離菌株的革蘭氏染色鏡檢結果（1 000×）Fig.3 Gram staining result of the isolated strain（1，000×）

2.3 生化鑒定

生化鑒定結果顯示：分離菌株能發酵葡萄糖并產酸產氣，不能發酵乳糖、麥芽糖、甘露醇和蔗糖；葡萄糖磷酸鹽胨水（MR）、葡萄糖磷酸鹽胨水（VP）、硫化氫和尿素試驗呈陽性；蛋白胨水、西蒙氏檸檬酸鹽試驗呈陰性（表3）。生化鑒定結果與奇異變形桿菌的生化特征相符合，結合細菌培養形態與生化特性可初步判定該菌為奇異變形桿菌，將其命名為YN2018株。

表3 分離菌株生化特性鑒定結果Tab.3 Biochemical identification results of the isolated strain

2.4 16S rRNA測序及遺傳進化樹分析

16S rRNA 分別擴增出大小為500、750、560 bp的條帶，與預期結果一致。測序結果拼接后獲得全長為1 387 bp 的序列。經BLAST 比對分析后，發現與NCBI 數據庫中已知菌株Proteus mirabilisATCC 29906 的同源性達到100%。從構建的系統發育樹（圖4）可知，YN2018 株的16S rRNA 基因與奇異變形桿菌（ATCC 29906、JCM 1669 和M17_J16）的親緣關系最為接近，處于同一分支；與變形肥桿菌（Obesumbacterium proteus，NCIMB 8771）有一定差異；與保科愛德華氏菌（Edwardsiella hoshinae，JCM 1679）、克雷伯氏菌（Klebsiellasp.，L3）和沙門氏菌（Salmonellasp.，D194-2）處于不同分支。因此，分離菌株YN2018株鑒定為奇異變形桿菌。

圖4 奇異變形桿菌16S rRNA核酸序列遺傳進化分析Fig.4 Phylogenetic analysis based on the 16S rRNA nucleotide sequences of Proteus mirabilis

2.5 細菌生長曲線

細菌生長曲線表明YN2018株接種2 h后進入對數生長期；16 h后進入穩定期（圖5）。

圖5 分離菌株YN2018株生長曲線Fig.5 Growth curve of the isolated YN2018 strain

2.6 藥敏試驗

YN2018株對復方新諾明、羅紅霉素、林可霉素、多西環素和卡那霉素等14 種抗菌藥物耐藥；對頭孢他啶、大觀霉素和頭孢噻肟敏感度較高；對慶大霉素、阿米卡星、阿莫西林、妥布霉素和鏈霉素中度敏感（表4）。

表4 藥敏試驗結果Tab.4 Drug sensitivity test result

2.7 細菌部分耐藥基因檢測

YN2018 株檢測到氨基糖苷類耐藥基因aadA1、aadB，磺胺類耐藥基因sul1、sul2，四環素類耐藥基因dfrA1，其余2 種β-內酰胺類和喹諾酮類耐藥基因均未檢測出（圖6）。

圖6 耐藥基因PCR擴增結果Fig.6 PCR amplification results of resistant genes

2.8 細菌部分毒力基因檢測

YN2018 株的毒力基因檢測結果表明，mrpA、rsbA、ureC、zapA、rsmA、hpmA、fliL、ucaA、pmfA和atfA毒力基因均被檢測到（圖7），目的條帶大小和預期一致。

圖7 毒力基因PCR擴增結果Fig.7 PCR amplification results of virulence genes

2.9 小鼠致病性試驗及病理切片觀察

試驗組小鼠攻菌1 h后表現為身體蜷縮，呆立不動，精神萎靡，食欲不振，被毛凌亂，6 h 后開始陸續死亡，48 h后再無死亡（圖8）。對照組小鼠行為表現均正常。從分離菌株對小鼠LD50的試驗結果（表5）得出YN2018 株的半數致死量（LD50）為2.02× 109cfu/mL。死亡小鼠剖檢可見肝臟淤血腫大，肺臟充血出血，腸道腫脹其內充滿黃色內容物。從試驗組死亡小鼠肝臟和肺臟組織中分離得到的病原菌生化特性和培養特性與YN2018 株一致，OMPA 鑒定除陰性對照外，均擴增出與文獻［19］大小一致的1 107 bp的目的條帶（圖9）。病理組織切片結果可見試驗組小鼠肝臟組織肝細胞壞死，胞核固縮深染，胞質崩解，伴有中性粒細胞浸潤，血管及肝竇淤血并擴張，肺臟組織的肺泡壁可見中性粒細胞浸潤，支氣管和血管周圍可見淋巴細胞浸潤，偶見血管重度擴張，管腔不規則，內皮細胞扁平化（圖10）。對照組小鼠肝臟和肺臟組織均正常。

圖8 不同濃度YN2018株對小鼠致病性試驗結果Fig.8 Pathogenicity test results of YN2018 strain with different concentrations on mice

圖9 奇異變形桿菌OMPA基因PCR擴增結果Fig.9 PCR amplification results of Proteus mirabilis OMPA gene

圖10 小鼠肝臟和肺臟病理組織切片（HE 200×）Fig.10 Histopathological observation of liver and lung in mice（HE 200×）

表5 分離菌株對小鼠LD50試驗結果Tab.5 LD50 test results of the isolated strain in mice

3 討論

野生動物是多種人獸共患病病原體的潛在攜帶者和傳播者，與攜帶病原體的野生動物接觸可造成人類和家畜感染，并存在人與人之間相互傳播的風險。奇異變形桿菌是重要的人畜共患條件致病菌，機體常因免疫力降低而感染發病，威脅家養畜禽、野生動物和人的健康，對畜禽養殖業造成嚴重經濟損失。據報道，雛雞感染該菌后可引起雛雞生長速度變慢和大批量死亡［20］；犢牛、成年牛［21］和豬［22］感染后可出現急性脫水腹瀉和死亡；母貉（Nyctereutes procyonoides）感染后可引起流產和發病死亡［23］。

本研究從發病死亡的野生馬來穿山甲肺臟組織中成功分離得到1 株致病菌，通過不同培養基形態觀察、革蘭氏染色鏡檢，發現其菌落形態和生長特性與翟頎等［24］從竹鼠肺臟組織中分離得到的奇異變形桿菌相似，16S rRNA 基因遺傳進化分析結果與奇異變形桿菌（ATCC 29906）高度同源且處于同一遺傳進化分支，最終確定該致病菌為奇異變形桿菌。進一步對該分離菌株進行生物學特性研究，發現該菌株生長繁殖快，對小鼠具有較強的致病性且病變明顯。菌株攜帶的毒力基因可能是影響致病過程和感染嚴重程度的主要因素。分析奇異變形桿菌攜帶毒力基因的情況有助于了解其致病性。相關研究表明，從導致鴨死亡的奇異變形桿菌中檢測出除rsbA的9種毒力基因［5］；從導致妊娠期母貉流產的奇異變形桿菌中檢測出除rsmA的9 種毒力基因［23］；從腹瀉動物糞便中分離得到的奇異變形桿菌存在的最普遍的毒力基因是ureC，ureC被作為靶基因用于鑒定奇異變形桿菌［25］。本研究發現10 種已報道的奇異變形桿菌毒力基因均可在YN2018 株中被檢測到，結合動物致病性試驗結果，這可能是導致YN2018株對小鼠表現出強致病性并引起野生馬來穿山甲死亡的重要原因。

篩選抗菌敏感藥物是有效防治細菌性疾病的重要方式之一，但隨著抗生素的廣泛使用，細菌耐藥性問題日益突出，逐漸引起人們的重視。奇異變形桿菌的耐藥性問題同樣不容忽視，龐洪澤等［26］報道了在10 日齡雛雞中分離得到的奇異變形桿菌對環丙沙星、林可霉素等5 種抗菌藥物敏感；董貴等［27］研究發現，導致新疆羔羊腹瀉的奇異變形桿菌對新霉素、復方新諾明等12 種抗菌藥物敏感。本研究分離的YN2018 株僅對頭孢他啶、頭孢噻肟和大觀霉素等 8 種抗生素敏感，其余受檢抗生素均表現為耐藥，不同來源的奇異變形桿菌藥物敏感性存在差異，可能與分離菌株所含的耐藥基因、宿主地域差異、使用抗生素不同和抗生素殘留等因素有關。耐藥基因介導了菌株的耐藥性和耐藥表型，研究發現YN2018株耐藥基因檢出與耐藥表型存在一定差異，β-內酰胺類和喹諾酮類耐藥基因均未檢出，但頭孢氨芐、氨芐西林和恩諾沙星等藥物表現為耐藥，與楊睿等［28］的奇異變形桿菌耐藥基因研究中喹諾酮類耐藥基因未完全檢出，但對喹諾酮類抗生素表現為耐藥的結果相似；氨基糖苷類藥物耐藥基因aadA1、aadB被檢出，aadA2未被檢出，卡那霉素、新霉素表現為耐藥，其余氨基糖苷類藥物表現為敏感。據此推測，YN2018株可能存在本研究未涉及的其他耐藥基因所介導的耐藥性和耐藥表型，或存在其他耐藥機制，需待進一步研究證實。

4 結論

本研究成功從野生馬來穿山甲肺臟組織中分離得到1 株奇異變形桿菌，命名為YN2018 株。該分離菌株攜帶的毒力基因種類較多，耐藥基因包括aadA1、aadB、sul1、sul2和dfrA1，藥敏試驗表現為多重耐藥，對小鼠有強致病性。本試驗對野生馬來穿山甲源奇異變形桿菌進行了系統研究，以期為野生馬來穿山甲源奇異變形桿菌的防治和研究提供參考。