麋鹿角柄發育規律與相關內分泌及信號通路檢測

夏志強，單云芳，李俊芳，張慶勛，賀永惠，崔艷紅，鐘震宇，柏 超，張成林，白加德，孟慶輝

（1.北京市科學技術研究院北京麋鹿生態實驗中心，北京，100076；2.河南科技學院動物科技學院，新鄉，453003；3.圈養野生動物技術北京市重點實驗室，北京動物園管理處，北京，100044）

有角動物存在于有蹄類反芻動物分支中，現存約80 個屬，近300 個種，超過30 億的個體［1］，其角可以分為骨質角和角質角2 個類群，鹿類是現存具骨質角的哺乳動物類群［2］。牛羊的角因內含骨質核［3］，終生不脫落，隨年齡增長逐漸變粗大，幼齡階段如因營養緊缺生長受限，待成年營養解除限制后，也無法代償性恢復生長［4］；而鹿角則不同，會周期性全部脫落，留下骨柄［5］，并在1～2個月內實現完全再生，后期逐漸骨化和脫落茸皮，把骨質角裸露在外，作為性選擇重要特征，參與繁殖爭霸［6］。出生后雄鹿角柄的激活對于鹿角的生長極為重要［7］，鹿類角柄的青春期發育對于鹿的個性與等級序位形成［8］、鹿角大小［9］、爭奪配偶［10］、種間競爭［11］及應對天敵［12］等有重要的意義。

麋鹿（Elaphurus davidianus）屬季節性繁殖動物，作為其強大攻擊和保護性武器的角，分枝向后與生境形成了完美匹配，成功占據了濕地生態位，導致其從演替出現直至滅絕都尚未走出濕地的死胡同窘境，成就了“成也麋鹿，敗也麋鹿”局面［13］。經過近38年的保護努力，中國境內共有10 000余頭麋鹿，重新恢復了野生種群，但是遺傳多樣性指數仍然較低，除大豐和石首2 種群超過1 000 頭外，其他分布地麋鹿均在200 頭以下且隨時可能面臨再次滅絕的風險，因此需要加強麋鹿保護界的居安思危和對麋鹿保護重啟新的重視［14］。本研究利用紅外測距儀，開展麋鹿角柄生長發育規律的宏觀測量；對不同年齡組1歲、2歲和3歲的角柄骨膜組織取樣，對信號通路表達和血液樣品激素水平進行檢測。角不僅可作為動物本身重要的性選擇標志，對于人類醫學也具有重要研究價值，針對麋鹿角柄骨膜發育的初步研究，以期為幼齡鹿類的飼養管理、鹿品種培育、茸再生、再生醫學和中藥材應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

1985 年從英國烏邦寺重引進的麋鹿，半散放于北京南海子，平均海拔9.6 m，年均氣溫13.1 ℃，年均降水量約600 mm，常年濕度30%～70%，年均日照時間5 000～6 200 h，無霜期（132.0±9.7）d［15］。麋鹿種群自由采食、飲水和繁衍，雄性麋鹿冬季解角。因受生態承載力限制，北京麋鹿種群常年維持在160～220頭，每年出生幼子50頭左右，其中雄性15～30頭。

試驗選取健康無病、體況優良、同父異母和出生日期（2018年4月5—25日）接近的雄性麋鹿，依出生時間佩戴耳標以阿拉伯數字編號。試驗麋鹿飼養方案：每日09：00、15：30各投喂1次，自由飲水，符合北京麋鹿苑麋鹿四季飼養管理方案，粗料為主，精料為輔［15］。

試驗分2 組，分別是角柄發育前、角柄發育后兩階段，其中角柄發育后階段又分為首次生茸前（12月1—22 日）和生茸期（12 月23 日—翌年3 月15 日）。血樣采集于2020 年1 月—2022 年12 月，每月第1 周周一上午，其中2020 年29 份，2021 年27 份，2022 年 20份，共76份。

1.2 研究方法

1.2.1 角柄發育與骨膜取樣

每日飼喂的同時觀察和測量幼齡麋鹿角柄發育及生茸狀況。對不同發育階段的角柄拍照，記錄角柄發育過程和生茸過程中頂端傷口愈合、分枝時間。角脫落后記錄編號，切取鹿角基部第1 片橫切片（厚1 mm），稱其質量［15］。2020、2021和2022年分別于生茸前和生茸期進行角柄皮下骨膜組織采樣，軟尺測量茸長度，記錄左、右側茸發育情況。組織取樣后立刻送回實驗室，分別浸泡在甲醛液中固定，-80 ℃冷凍保存。

1.2.2 血液激素水平檢測

采用上海酶聯生物科技有限公司的酶聯免疫試劑盒測定血清中的激素含量，提前將試劑盒從冷藏環境中取出，室溫平衡1～2 h。（1）加樣：標準孔加不同濃度的標準品50 μL；待測樣品孔中先加稀釋液40 μL，再向孔底部加入血清樣品10 μL，輕晃均勻。（2）加酶：除空白孔外，每孔加入100 μL。（3）溫育：封板，干燥箱中37 ℃溫育60 min。（4）配液：洗滌液稀釋后備用。（5）洗滌：每孔加滿洗滌液，靜置30 s 后棄去，重復5次。（6）顯色：加入顯色液A 50 μL，顯色液B 50 μL，混勻后置于37 ℃避光顯色15 min。（7）終止：加終止液50 μL 終止反應。（8）測定：450 nm 波長測量各孔的吸光度（OD 值）。繪制標準曲線，計算實際濃度。

1.2.3 信號通路檢測

稱取樣品組織，利用Trizol 法提取組織RNA，并通過紫外分光光度計檢測RNA 樣品濃度及純度。根據反轉錄試劑盒對RNA 進行反轉錄，反轉錄結束后將樣品稀釋分裝保存。參照NCBI 網站提供的馬鹿基因序列，利用Primer Premier 5.0 軟件設計所需引物，所有引物均由北京擎科創新生物科技有限公司合成，具體引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列Tab.1 Primer sequence of RT-PCR

1.2.4 數據處理

試驗結果均符合正態分布，齊次性檢驗中，若方差齊時選擇LSD 法檢驗各個水平間存在的差異；若方差不齊時選擇Tamhane’s T2 檢驗總體方差不等的兩組之間的差異，通過使用ANOVA 分析及LSD多重比較來分析不同激素的年度變化及判斷不 同激素與角柄及茸再生的相關性差異。顯著性水平α＜0.05。

2 結果

2.1 角柄發育

初生仔鹿額部未表現隆凸，僅有左右對稱的逆序毛旋，旋毛稍長、色深；雄性麋鹿在第1 年秋季開始出生后的角柄發育，由毛旋處長出骨質突起，逐漸形成初角基，是茸角生長的基礎；翌年2—3 月角柄長度2.5～3.0 cm，初角茸不分枝，與成年麋鹿不同，5—6月陸續開始首次生茸，冬至脫落，形成完整的角柄。經初角茸后，角柄繼續發育，直至體成熟，角柄骨膜不斷地持續增殖，在此期間，鹿角每年發生周期性脫落，翌年茸再生變大分枝增多；角柄逐漸變粗變短，至完全成熟（圖1）。

圖1 幼齡階段雄性麋鹿角柄發育Fig.1 Antler pedicle development in young male Père David’s deer

亞成體麋鹿角脫落與再生期角柄的發育，也主要經歷生茸初期、快速生長期及生茸后期等階段。（1）生茸初期，脫角形成的碗狀傷口1～2 d 結痂，傷口周圍“皮膚環”增殖變厚，是茸生長的基礎［8］。生茸8～9 d 表面開始長出稀疏淺白色茸毛，中心傷口結痂也不斷向內收縮變小，鹿茸主枝形成，生長速度逐漸加快。此階段，角柄逐漸恢復營養供給，變粗大，骨芯代償加快，皮膚和血管也開始活躍，代謝加速，為下一階段茸快速生長做足準備。（2）快速生長期，茸主枝增長到一定長度后頂端出現2 個生長中心（生茸23～25 d），待眉枝完全出現（生茸30 d 左右），結痂脫落，傷口處完全愈合且不留疤痕，是皮膚再生能力的體現［9］。此時，角柄代謝達到 最旺盛狀態，局部血液循壞加快，角柄秋季萎縮 造成的阻塞管道全部打通，營養供給達年度最高峰，角柄和茸生長最快。（3）生茸后期，鹿茸成型并逐漸停止增長（生茸70 d），鹿茸開始骨化變硬，茸皮逐漸脫落，最終形成堅硬鹿角。角柄也逐漸開始萎縮，血管封閉，鈣磷代謝減慢，并有少部分礦物質回流（表2）。

表2 鹿茸生長階段及角柄特征變化Tab.2 Characteristics of Père David’s deer antler and pedicle in different growth stages

隨年齡增長角柄不斷地變粗成熟，雄鹿由于每年生茸前，角柄內部鈣質被吸收，脫落時帶走了部分死亡的細胞和骨質，老年后角柄逐漸縮短，角基盤和生長面不斷擴大和下移；解角后，創面逐年變大，封口時間逐年延長。

2.2 角柄發育參數

青春期角柄第2 次發育后，隨年齡增長，逐漸變粗；老年后隨脫落次數增多，角柄逐漸變短。角柄圍長由2 歲時的（17.17±1.00）cm 增加到3 歲時的（35.43±0.83）cm，差異極顯著（F1，9=4.128 1，n=9，p=0.005 3）；角柄直徑由2 歲時的（3.66±0.59）cm 增加到3歲時的（5.91±0.72）cm，差異極顯著（F1，9=3.174 0，n=9，p=0.024 6）；角橫切面外徑長由2 歲時的（10.30±1.25）mm增加到3歲時的（32.50±3.11）mm，差異極顯著（F1，9=5.266 1，n=9，p=0.000 9）；角橫切面外徑寬由2 歲時的（7.60±0.83）mm 增加到3 歲 時的（27.50±1.84）mm，差異極顯著（F1，9=4.820 3，n=9，p=0.001 5）（表3）。

表3 不同年齡段麋鹿角柄生長數據Tab.3 Growth data of Père David’s deer antler pedicle at different ages

2.3 血液激素水平

幼齡雄性麋鹿睪酮的分泌水平與角柄發育密切相關，生長素、IGF-1 與角柄發育也存在關聯。睪酮分泌水平由1 歲時的（564.27±41.16）pg/mL 增加到3 歲時的（737.96±66.57）pg/mL，差異極顯著（F1，9=4.303 0，n=9，p=0.002 2）；生長素分泌水平由1 歲 時的（3.10±0.32）ng/mL 增加到3 歲時的（6.60± 0.57）ng/mL，差異顯著（F1，9=2.511 5，n=9，p=0.035 9）；IGF-1 分泌水平由1 歲時的（122.55±12.21）ng/mL增加到3 歲時的（169.13±33.18）ng/mL，差異顯著（F1，9=2.773 0，n=9，p=0.020 1）（表4）。

表4 不同年齡段幼齡雄性麋鹿血液激素水平Tab.4 Blood hormone levels of young male Père David’s deer at different ages

2.4 信號通路表達水平

信號通路TGF-β/Smads 與幼齡麋鹿角柄骨膜發育有關。TGF-β1mRNA 相對表達水平由角柄萌發前的（1.07±0.04）增加到3 歲時的（4.47±1.14），差異極顯著（F1，9=3.711 7，n=9，p=0.006 6）；TGF-β1RmRNA 相對表達水平由角柄萌發前的（0.96±0.07）增加到3 歲時的（2.01±0.34），差異極顯著（F1，9=3.332 9，n=9，p=0.009 9）（表5）。

表5 幼齡麋鹿角柄組織mRNA相對表達情況Tab.5 mRNA relative expression in antler pedicle tissues of young male Père David’s deer

3 討論

不同鹿科（Cervidae）動物因分布緯度不同，占據生態位不同，丘陵狍（Capreolus pygargus）、林緣梅花鹿（Cervus nippon）、高山森林馬鹿（C.elaphus）和平原濕地麋鹿的鹿角脫落周期節律與繁殖期節律各異［16］。平原濕地麋鹿因生態位決定［13］需要在5 月底開始圈群、打斗、爭奪配偶和繁殖［17］，所以須在嚴寒冬季，微調內分泌水平和相關因子表達水平，提前開始舊角脫落和新茸再生，使其在發情期到來之前形成堅實的硬角，參與競爭繁殖。而幼齡麋鹿與成年麋鹿不同［15］，出生后第2年5—6月開始首次生茸（出生后第2年2—3月角柄生長長度為2.5～3.0 cm，為初角基），冬至脫落，此時形成完整的角柄［18］。青春期麋鹿經初角茸后，角柄則繼續發育，直至體成熟［19］，角柄骨膜不斷地持續增殖，在此期間，鹿角每年發生周期性脫落，翌年茸再生變大在原來基礎上分枝逐漸增多［8，20］，推測角柄骨膜細胞具有記憶功能。

本研究表明，青春期雄性麋鹿睪酮分泌水平與角柄發育密切相關（F1，9=4.303 0，n=9，p=0.002 2），生長素、IGF-1 與角柄發育存在關聯，信號通路TGFβ/Smads 也參與了角柄骨膜的發育。TGF-β1 可能收到來自雄激素刺激的下游信號激活鹿茸角柄骨膜組織細胞膜上的受體，隨后由Smad2、Smad3 將信號傳遞到角柄骨膜組織細胞核內并與Smad4 結合形成復合物，識別靶基因并調控轉錄因子的表達，最終完成信號的傳遞和角柄的增殖。結果顯示，在角柄骨膜快速增殖的細胞分裂階段，TGF-β/Smads通路十分活躍，說明TGF-β1 還能通過參與調節鹿茸骨膜細胞的細胞分裂周期，增加S 期細胞比例，并可能促進細胞周期的轉換，參與骨膜細胞增殖。

角柄是鹿茸周期性再生的基礎［21］。幼齡鹿類角柄發育及調控研究目前仍進展緩慢，本研究對麋鹿角柄發育及機制開展了初步研究，探討了幼齡階段雄性麋鹿激素發育水平的變化規律與相關分子表達情況，為持續開展麋鹿角柄發育、舊角脫落與新茸冬至再生多樣化機制奠定了基礎，對提高幼齡鹿類的管理與福利水平等有重要實際應用意義。

致謝：本研究是在北京麋鹿生態實驗中心多位員工的參與下共同完成的，在此對所有參與人員表示感謝。