多囊卵巢綜合征患者外周血單核細胞TLR4表達及其與胰島素抵抗指數(shù)的相關(guān)性

王亞妹，謝寶國

1 海南醫(yī)學院，海口 570102；2 海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學科；3 海南省臨床醫(yī)學中心；4 海南省人類生殖與遺傳重點實驗室

多囊卵巢綜合征（PCOS）是導致育齡女性生殖內(nèi)分泌激素紊亂的最常見疾病［1］。研究［2］表明，PCOS患者外周循環(huán)中促炎細胞因子升高以及慢性炎癥反應貫穿多個病理環(huán)節(jié)。胰島素抵抗（IR）是PCOS患者的主要特征之一，炎癥因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細胞介素-6（IL-6）可通過改變脂肪細胞中的胰島素信號分子導致IR［3］。因此，炎癥細胞因子與IR的發(fā)生機制密切相關(guān)。Toll樣受體4（TLR4）是TLRs家族中研究最多的受體，參與脂肪細胞IR和慢性炎癥反應的過程，可誘導促炎因子的產(chǎn)生，導致組織特異性效應受損［5］。單核細胞是免疫系統(tǒng)中關(guān)鍵的炎癥細胞，在PCOS慢性炎癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。有資料顯示，PCOS患者體內(nèi)單核細胞數(shù)量增多，且單核細胞通過分泌TNF-α和IL-6等炎癥因子，不僅參與慢性炎癥，還可能導致IR和雄激素釋放增多。目前鑒于TLR4在PCOS患者外周血單核細胞中表達相關(guān)研究極少。本研究觀察了PCOS患者外周血單核細胞TLR4 mRNA、蛋白表達，并分析TLR4 mRNA與胰島素抵抗的關(guān)系，旨在探討TLR4在IR發(fā)病機制中的作用，嘗試以該因子為切入發(fā)現(xiàn)新的PCOS治療靶點。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2020年11月—2021年11月收治的PCOS患者30例（觀察組），年齡25～35（27.2 ± 4.8）歲，BMI（25.4 ± 4.2）kg/m2。健康女性20例（對照組），年齡25～35（27.5 ± 4.3）歲，BMI（24.8 ± 4.5）kg/m2。觀察組納入標準：①根據(jù)鹿特丹標準［6］診斷PCOS，其中至少滿足以下兩項標準：稀發(fā)排卵或無排卵［＜8次/年的排卵且月經(jīng)周期超過35天，無月經(jīng)來潮6個月）、高雄激素血癥和（或）其臨床表現(xiàn)、超聲檢查提示卵巢多囊形態(tài)（單側(cè)或雙側(cè)卵巢中直徑為2～9 mm的卵泡≥12個，和（或）卵巢體積≥10 mL］；②無內(nèi)科合并癥。對照組納入標準：①健康女性月經(jīng)周期規(guī)律（21～35 d）；②無多毛癥證據(jù)；③超聲檢查無多囊卵巢形態(tài)。排除標準：①患有全身性疾病（心血管疾病和糖尿病等）；②高泌乳素血癥；③研究前用藥≤6個月（口服避孕藥、糖皮質(zhì)激素、排卵誘導藥物、雌激素或抗雄激素藥物等）；④造成高雄激素血癥的疾病，如腎上腺腫瘤等；⑤甲狀腺功能異常的疾病。本研究經(jīng)海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準，獲得所有女性的書面知情同意書。

1.2 外周血單核細胞TLR4 mRNA、蛋白檢測 ①單核細胞分離及鑒定：收集觀察組和對照組的血液樣品，將每個受試者5 mL靜脈血至EDTA抗凝管內(nèi)靜置，使用Ficoll-Paque plus密度梯度離心法分離外周血單核細胞。以2000 g離心20 min后，收集細胞并加入適量含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基重懸細胞。臺盼藍染色法檢測單核細胞存活率達90%以上。取一定體積的細胞懸液行流式細胞CD14檢測鑒定單核細胞。②TLR4 mRNA檢測：采用熒光定量PCR法。使用TRIzol試劑盒提取單核細胞總RNA。提取完成后即采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳法測定所提總RNA樣品完整性，紫外分光光度計測定RNA濃度和純度，測得OD 260/280吸收比＞1.8，可儲存于-80℃下備用。以細胞總RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)SYBR Premix Ex TaqTMII試劑盒說明書構(gòu)建qRT-PCR反應體系，置于ABI Prism 7300序列檢測系統(tǒng)上完成反應，反應程序為：95 ℃下預變性5 min；95 ℃下15 s，60 ℃下30 s，72 ℃下15 s，重復40個循環(huán)。作為內(nèi)部對照，在相同的反應條件下檢測β-actin mRNA的表達。實驗重復3次。擴增后，對形成的產(chǎn)物進行解鏈曲線分析。采用2-ΔΔCt法計算目的基因mRNA的相對表達水平。③TLR4蛋白檢測：采用蛋白質(zhì)印跡法。使用細胞裂解緩沖液和蛋白酶抑制劑混合物從外周血單核細胞中提取總蛋白。在4 ℃下以10000 g離心15 min后，按Bradford蛋白質(zhì)測定試劑盒說明書測定各組樣品蛋白濃度，并進行SDS-PAGE凝膠電泳，并轉(zhuǎn)至PVDF膜上。在室溫下，5%脫脂奶粉封閉2 h，TBST清洗（10 min×3次），加入相應蛋白一抗（稀釋比例1∶1000）4 ℃過夜孵育。次日取出后加相應辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗（稀釋比例1∶2000）室溫孵育2 h，TBST清洗（10 min×3次）。免疫印跡化學發(fā)光法檢測蛋白條帶。在Bio-Rad Quantity One上使用掃描密度測定條帶強度。

1.3 胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）計算 計算HOMA-IR，HOMA-IR=空腹胰島素（mIU/L）×空腹血糖（mmol/L）/22.5，HOMA-IR≥2.5定義為IR。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，組間比較采用Student t檢驗或Mann-Whitney檢驗；相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組外周血單核細胞TLR4 mRNA、蛋白表達比較 外周血單核細胞TLR4 mRNA、蛋白表達比較見表1。

表1 兩組外周血單核細胞TLR4 mRNA、蛋白表達比較（±s）

表1 兩組外周血單核細胞TLR4 mRNA、蛋白表達比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05。

組別觀察組對照組n 3020 TLR4 mRNA 1.36 ± 0.28*0.98 ± 0.14 TLR4蛋白1.40 ± 0.270.74 ± 0.15

2.2 兩組HOMA-IR比較 觀察組及對照組HOMA-IR分別為4.36 ± 2.12、1.69 ± 0.56，兩組比較，P＜0.05。

2.3 觀察組TLR4 mRNA表達與HOMA-IR的相關(guān)性 觀察組單核細胞中TLR4 mRNA表達與HOMAIR呈正相關(guān)（r=0.8454，P＜0.05）。

3 討論

PCOS是一種由多種遺傳和環(huán)境因素共同作用下嚴重危及女性健康的復雜疾病，是不孕癥的常見原因之一，影響著全球4%～20%的育齡女性［7］。PCOS患者卵巢較正常女性明顯增大2～5倍，以生殖內(nèi)分泌和血糖血脂代謝紊亂等為主要特征，如雄激素水平過高、LH升高、持續(xù)無排卵、糖耐量受損、高胰島素血癥、胰島素抵抗等［8］。IR是PCOS的顯著特征之一，也是備受關(guān)注的主要問題。臨床常用于評估胰島素敏感性/抵抗的測量工具是利用空腹血糖和空腹胰島素計算的HOMA-IR指數(shù)［9］。IR不僅直接影響PCOS女性生殖功能障礙，還導致代謝相關(guān)的并發(fā)癥如糖尿病、心血管疾病、子宮內(nèi)膜癌等發(fā)病風險增加［10］。研究［11-12］顯示，超過60%的PCOS患者存在IR，其中糖耐量受損的發(fā)生率約為35%，2型糖尿病發(fā)生率約為10%。

人體內(nèi)炎癥反應受許多轉(zhuǎn)錄因子的精細調(diào)控，反應失控會造成大量炎癥細胞和促炎細胞因子過度釋放損傷機體組織和器官，進而產(chǎn)生一系列相關(guān)的慢性疾病［13］。PCOS被稱作是一種慢性低度炎癥狀態(tài)，又稱為代謝性炎癥，雖缺乏典型炎癥反應的特征，但可通過相似的炎癥信號通路發(fā)揮作用［14］。有學者將這種慢性炎癥歸因于內(nèi)臟脂肪堆積或IR，當機體存在大量游離脂肪酸，脂肪細胞會出現(xiàn)代償性增多，隨之增大的脂肪組織因缺氧或灌注不足導致細胞缺氧壞死，募集許多炎癥細胞產(chǎn)生大量促炎因子引起炎癥反應［15］。多項研究［4，16］表明，IL-6、IL-1β、C反應蛋白（CRP）和TNF-α等炎癥反應介質(zhì)與PCOS密切相關(guān)，PCOS患者血清TNF-α、IL-6和CRP表達量增高，顆粒細胞和卵泡液中IL-1β表達量增高。最新研究還發(fā)現(xiàn)，促炎因子IL-34在PCOS患者中表達水平升高，表達量與IR呈正相關(guān)。此外，HA等［17］發(fā)現(xiàn)，PCOS患者血清TNF-α與IR呈顯著正相關(guān)，通過治療IR可改善慢性低度炎癥狀態(tài)。

TLR4是天然免疫應答中的主要受體，受多種細胞因子的調(diào)節(jié)，可通過激活介導細胞內(nèi)信號通路，導致促炎細胞因子的轉(zhuǎn)錄水平升高。核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）是一種公認的轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)節(jié)促炎因子（如TNF-α和IL-1）的產(chǎn)生。QI等［18］發(fā)現(xiàn)，TLR4可通過激活NF-κB啟動細胞內(nèi)信號通路，導致促炎因子轉(zhuǎn)錄水平升高，這與PCOS慢性炎癥狀態(tài)相關(guān)。TLR4表達與IR的發(fā)生密切相關(guān)，脂肪細胞中存在慢性炎癥反應。PRASAD等［19］認為，促炎因子TNF-α通過抑制胰島素信號通路、干擾葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4的表達和改變脂肪因子水平等途徑導致IR發(fā)生。IR也會因高血糖而引起氧化應激增強，產(chǎn)生活性氧（ROS），ROS增加激活NF-kB信號通路，促進TNF-α、IL-6等炎癥介質(zhì)釋放。此外飽和脂肪酸激活TLR4信號傳導進而導致IR，IR也可能通過TLR4誘導的炎癥反應所造成。本研究發(fā)現(xiàn)，PCOS患者TLR4 mRNA、蛋白表達均明顯高于正常健康女性，這表明PCOS患者外周血單核細胞中TLR4呈高表達，提示TLR4介導的炎癥信號途徑在PCOS慢性炎癥的產(chǎn)生中發(fā)揮一定程度作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)，PCOS患者TLR4 mRNA表達與HOMA-IR呈正相關(guān)，這表明PCOS患者出現(xiàn)IR與TLR4 mRNA相關(guān)，且TLR4 mRNA表達越高，胰島素抵抗越嚴重，進而可能導致PCOS患者發(fā)生不良并發(fā)癥，如糖尿病、不孕癥、代謝綜合征、甚至癌癥等風險增加。因此，通過干擾TLR4的表達可能為PCOS合并IR患者提供新的治療依據(jù)。

總之，發(fā)現(xiàn)TLR4在PCOS患者外周血單核細胞中高表達，且TLR4 mRNA表達與HOMA-IR呈正相關(guān)，證實TLR4的高表達與PCOS的慢性炎癥狀態(tài)及IR密切相關(guān)。由于過去PCOS的病因在很大程度上仍不明確，因此既沒有治愈方法，也缺乏基于機制的治療措施，導致管理患者不理想，只注重對癥治療。但是隨著現(xiàn)階段學者們對PCOS的發(fā)病機制越來越深入的了解，對于PCOS的治療理念也不再局限于單純的對癥處理，而是爭取從發(fā)病機制為切入點尋找更具特異性且有效性的治療靶點，為預防遠期并發(fā)癥和減緩疾病的病情發(fā)展創(chuàng)造一定的可能性。本研究的這些發(fā)現(xiàn)提示TLR4可能是PCOS發(fā)病的潛在機制，干預TLR4的表達可能為PCOS的治療提供一個嶄新的視角。