一例羊皮下膿腫病原的分離鑒定及藥敏試驗

彭艷伶，劉鳳尾，周可磊，唐國強，李 昊

（1.四川省涼山州西昌市動物疫病預防控制中心，四川 西昌 615050；2.四川省涼山州動物疫病預防控制中心，四川 西昌 615050；3.西昌學院，四川 西昌 615050）

羊干酪性淋巴結炎（CLA）又被稱為山羊體表皮膚膿包病，主要是由葡萄球菌、偽結核棒狀桿菌和壞死桿菌等多種病原微生物感染導致［1-4］。該病通常發生于乳房、面頰和頸部等部位，病程一般持續幾周或數月，病原菌在感染處大量繁殖，產生的毒素會引起病羊發生毒血癥或敗血癥，甚至死亡［5-6］，同時影響哺乳期羔羊的生長發育，對養羊業危害較大［7-8］。本研究對一起山羊的皮膚膿包病進行病原確診，以便針對性防治。

1 材料與方法

1.1 發病情況和臨床癥狀 2022年6月，四川某羊場一周內連續有多只羊發生皮下腫脹，患病羊的頜下、乳房、面頰和頸部等部位發生膿腫、潰瘍，觸動有波動感，局部體溫升高，用無菌注射器穿刺可見乳白色膿汁（圖1）。

圖1 發病羊群臨床癥狀

1.2 主要試劑 全基因組DNA 提取試劑盒，rTaq DNA聚合酶，DNA Marker DL 2000，革蘭氏染色液，血瓊脂平板，TSA瓊脂培養基和TSB肉湯培養基。

1.3 細菌的分離鑒定 將無菌采集的2 份樣本分別接種于含有10%小牛血清的TSB 肉湯培養基中，37 ℃搖床過夜培養16～24 h，增菌后接種于血瓊脂平板上，37 ℃培養16～24 h。觀察菌落的生長狀況，挑取疑似單個菌落在血瓊脂平板上純化3次，革蘭氏染色、鏡檢，觀察細菌形態，并對純化后的細菌進行16S rDNA通用引物PCR鑒定。

1.4 基因組DNA 提取 吸取培養24 h 的菌液1 mL，經12 000 r/min 離心2 min，棄上清液，后續步驟參照細菌全基因組DNA 提取試劑盒說明書操作，DNA于-20 ℃保存備用。

1.5 細菌16S rDNA 擴增及測序 使用細菌16S rDNA 通用引物（27F：5'-AGAGTTTGATCCT GGCTCAG-3'；1492R：5'-TACGGCTACCTTGTTA CGACTT-3'）進行PCR 擴增，擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳確認。引物由上海生工生物有限公司合成。

1.6 生化試驗 將平板上純化的分離菌株接種于TSB 培養基中，37 ℃搖床培養24 h 后，接種于葡萄糖、蔗糖、半乳糖、麥芽糖、乳糖、果糖、甘露糖、甘露醇、非甘露醇試管中，37 ℃培養24 h，觀察主要生化特性。

1.7 藥敏試驗 測定分離菌株對10類28種抗生素的敏感性，抗生素包括：β-內酰胺類（青霉素、阿莫西林），頭孢菌素類（頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢氨芐、頭孢噻吩、頭孢呋辛、頭孢哌酮），氨基糖苷類（鏈霉素、慶大霉素、丁胺卡那、卡那霉素），大環內酯類（紅霉素、麥迪霉素、克林霉素），多肽類（桿菌肽、多粘菌素B），四環素類（四環素、多西環素），喹諾酮類（恩諾沙星、環丙沙星、左氧氟沙星、諾氟沙星、氧氟沙星），磺胺類（磺胺異惡唑、復方新諾明），氯霉素類（氟苯尼考），林可酰胺類（克林霉素）。

1.8 系統進化樹構建 將測序獲得的序列登錄NCBI 網站，利用Blast 模塊進行序列比對，利用Mega7.0軟件構建進化樹進行遺傳進化分析。

2 結果

2.1 細菌的分離與培養 將采集的2 份樣本接種于營養瓊脂及10%綿羊血平板中，37 ℃培養24 h后觀察，僅發現兩種形態不一致的菌落，其中平板1 菌落為肉眼可見的白色，不透明，表面光滑，染色鏡檢為革蘭氏陽性菌（見圖2A和圖3A）；平板2菌落為肉眼可見的灰白色，光滑露珠樣，染色鏡檢為革蘭氏陰性菌，進一步挑取單菌落進行瑞氏染色，在顯微鏡下可以觀察到短桿菌（見圖2 B和圖3B）。

圖2 菌株在TSA固體培養基上的生長情況

圖3 菌株革蘭氏染色鏡檢結果

2.2 菌株的PCR和分子生物學鑒定 以菌株基因組DNA 為模板，利用細菌16S rDNA 通用引物進行PCR 擴增，對獲得的擴增產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示擴增產物大小在1 500 bp左右，與預期相符（圖4）。將所得序列提交至NCBI比對，發現1號分離菌株與金黃色葡萄球菌16S rDNA序列的相似度最高，2號分離菌株與溶血性曼氏桿菌16S rDNA 序列的相似度最高。構建的系統進化樹顯示：1 號分離菌株與GenBank中公布的金黃色葡萄球菌的親緣關系最近；2 號分離菌株與GenBank 中公布的溶血性曼氏桿菌株的親緣關系最近（圖5）。

圖4 1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果

圖5 分離菌株與參考菌株16S rDNA序列的進化樹分析

2.3 生化試驗 表1結果顯示：1號分離菌株對葡萄糖、蔗糖、半乳糖、麥芽糖、果糖、甘露醇、乳糖、甘露糖的生化反應呈陽性，而非甘露醇為陰性反應；2號分離菌株對葡萄糖、蔗糖、半乳糖、麥芽糖、果糖、甘露醇的生化反應呈陽性，而非甘露醇、乳糖、甘露糖為陰性反應。該試驗每個反應管做了3 次重復，結果一致。1 號分離菌株符合金黃色葡萄球菌的生化特性，2 號分離菌株符合溶血性曼氏桿菌的生化特性。

表1 分離菌株的生化試驗結果

2.4 藥敏試驗 表2結果顯示：兩株分離菌株均對頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢氨芐、頭孢塞吩、頭孢呋辛、慶大霉素、丁胺卡那、鏈霉素、四環素、多西環素、左氧氟沙星、諾氟沙星、氟苯尼考、克林霉素、頭孢哌酮、麥迪霉素、氧氟沙星、卡那霉素等藥物敏感，而對青霉素、多粘菌素B、復方新諾明、桿菌肽、磺胺異惡唑等耐藥。

表2 藥敏試驗結果 mm

3 討論與結論

多種病原都可以導致羊皮下膿腫，發病機制復雜，目前尚無有效的疫苗防治手段。加強生物安全措施，減少環境病原菌，對患病動物早期精準的診斷并及時針對性治療，是控制該病的主要措施。先前研究認為只有偽結核棒狀桿菌可導致羊皮下膿腫，但近年來的研究表明，金黃色葡萄球菌等也是該病重要的病原菌，目前還沒有溶血性曼氏桿菌導致膿包病的報道。2018年，Roccaro等［8］從意大利某羊場暴發的綿羊膿包病病料中檢測到大量葡萄球菌。楊金柯等［9］研究表明山羊皮膚膿包病原中葡萄球菌屬占有絕對優勢（98.04%），說明葡萄球菌是引起羊膿包病的主要病原菌。溶血性曼氏桿菌屬于機會致病菌，可長期寄生于反芻動物以及其他動物的上呼吸道［10］，主要引起肺炎、新生羔羊敗血癥、羊乳腺炎等，很少有研究報道溶血性曼氏桿菌可導致羊皮下膿腫［11-12］。

本研究從發病羊皮下膿腫組織樣本中分離出2 株細菌，經綜合鑒定為金黃色葡萄球菌和溶血性曼氏桿菌。兩株分離菌株對頭孢菌素類、氨基糖苷類等多種抗菌藥物都較敏感，而對青霉素、多粘菌素B、桿菌肽等表現出耐藥性，這可能與菌株來源、畜種差異以及不同養殖場的用藥習慣有關。感染養殖場應根據實驗室診斷結果以及藥敏試驗結果，采取科學、有效的用藥方案，避免抗生素濫用。