擴張型心肌病動物模型的建立與評估

張 冬 朱瑾彥 張 敏 李 彬

(1.首都醫科大學附屬北京積水潭醫院,胸外科 北京 100037)(2.中國醫學科學院,北京協和醫學院,國家心血管病中心,阜外醫院,心血管疾病國家重點實驗室,心血管植入材料臨床前評價北京市重點實驗室,動物實驗中心,北京 100037)

擴張型心肌病(dilated cardiomyopathy, DCM),是指以單側或雙側心腔擴大、心肌收縮期功能減退、伴或不伴有充血性心力衰竭為主要特征的心肌病[1]。在我國發病率為13/10萬～84/10萬不等。迄今為止,病因不明[2-4]。其明顯的病理改變主要以心腔擴張為主,可見室壁變薄,心肌纖維化加重并伴有癜痕形成。病理組織學表現為:心肌細胞的非特異性肥大、變性,特別是程度不同的纖維化等病變混合存在[5-7]。

本病的病程長短不等,可表現為充血性心力衰竭,以往認為癥狀出現后5年的存活率只有40%左右[8]。因為DCM病因不明,預后較差,且目前除心臟移植,并無特異、有效的治療方法,故臨床上對于DCM的研究必要而迫切。為深入研究DCM的發生發展特點,建立相關實驗動物模型是一種十分有效的手段。為此,旨在探索建立DCM的犬動物實驗模型,并對其模型的有效性及穩定性予以評估。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物及分組:實驗動物采用成年比格犬10只(雌雄不限,體質量10～20 kg), 購于北京金牧陽實驗動物養殖有限責任公司, 生產許可證號【SCXK(京)2015-0005】，飼養于中國醫學科學院阜外醫院動物實驗中心,使用許可證號【SYXK(京)2017-0015】。實驗室溫度20～25 ℃,相對濕度50%～70%,換氣次數每小時8～10次,采用12 h/12 h晝夜間斷照明。實驗動物耳標編號,自由攝食、飲水,實驗方案通過阜外醫院實驗動物福利與倫理委員會審查,倫理審批號:0092-3-20-ZR(X)。

實驗動物分組:正常對照組(CTL組):4只;擴張型心肌病模型組(DCM組):6只。

1.1.2主要儀器設備:麻醉機(ACM619,北京航天長峰股份有限公司醫療器械分公司)、心電監護儀(MP50)、彩色多普勒超聲心動儀(IE33)(飛利浦公司)、ACT測量儀及耗材(ACTⅡ,HEMOCHRON)、24 h動態心電圖機(Reveal XT 9529)、植入式心電事件監測器(ICM)(LNQ11,美敦力)、心臟電生理刺激儀(DF-5A,蘇州東方電子儀器廠)。

1.1.3實驗試劑:異氟烷(山東科源制藥有限公司)、丙泊酚中/長鏈脂肪注射液(北京賈森尤斯卡比醫藥有限公司)、鹽酸利多卡因注射液(中國大冢制藥有限公司)、地高辛(江蘇恒瑞醫藥股份有限公司)、呋塞米(常州千紅生化制藥股份有眼公司)、注射用頭孢氨芐(華北制藥股份有限公司)、華法林(Orion)、氯化鉀注射液(中國大冢制藥有限公司)等。

1.2 方法

1.2.1DCM動物模型的建立:實驗動物麻醉采取氣管插管及全身麻醉,麻醉試劑使用丙泊酚(4～12mg/kg)誘導麻醉和異氟烷(2%～4%)吸入維持麻醉。呼吸機輔助呼吸,潮氣量12 mL/kg,維持血氧飽和度100%。

動物常規麻醉后,股動脈穿刺,穿刺順利后置入5F鞘管,透視下將5F的Judkins導管置入左冠狀動脈,在左主干注入阿霉素(多柔比星)。阿霉素溶解于20 mL 0.9%氯化鈉溶液中,每次的注射劑量為0.7 mg/kg。每周注射一次,連續注射5周。

正常對照組同樣進行麻醉,麻醉后同樣置入導管,在相同位置注射等量不含阿霉素的0.9%氯化鈉溶液。每周注射一次,連續注射5周。成模標準:LVEF<30%。

1.2.2超聲心動圖檢查:末次注射4周后對全部分組動物進行超聲心動圖檢查。

動物在麻醉狀態下,取胸骨旁長軸切面, 在二維超聲引導下用M 型超聲進行測量,計量資料連續測量3個心動周期取平均值。測定指標包括:左房內徑(LA)、左室舒張末內徑(LVEDD)、左室收縮末內徑(LVESD)、室間隔厚度(IVSD)。每搏輸出量(SV)、左室射血分數(EF)及左室短軸縮短率(FS)。

1.2.3血流動力學參數的測定:動物在麻醉狀態下進行血液動力學監測。采用多導生理記錄儀及心導管技術測量左室壓力曲線,測定左室收縮壓(LVSP)、左室舒張末壓(LVEDP)、左室內壓最大上升/下降速度(dp/dtmax)。每次測量均取連續10個心動周期的平均值。

1.2.4血液學檢測:末次注射4周后對全部動物抽6 mL靜脈血完成血常規、生化檢查、凝血及心臟相關檢查。

1.2.5心室重構評價

1.2.5.1組織病理學纖維化程度檢測:病理學檢查均為左心室心尖部同一位置處心肌結構的對比,從而排除不同部位心肌結構改變所帶來的影響;同時對同一位置處心肌結構多點(>3)取材進行病理切片檢查,進而排除病理切片制片過程中的影響。

將動物安樂死,取出心肌組織于4% 多聚甲醛溶液固定,常規石蠟包埋,組織切片后行常規HE染色和Masson染色,于光鏡下觀察心肌組織纖維化及病理形態改變。應用Image Pluse 5.1 計算機軟件分析檢測心肌組織膠原容積分數(CVF),CVF 為心肌纖維化面積與心肌總面積比值。

1.2.5.2免疫組化檢測組織Collagen I/III水平:對組織內的Collagen I/III進行免疫組化檢測,半定量測定。采用蛋白免疫印跡(Western blot)法:處死實驗動物后取心肌組織標本100 mg, 剪碎、離心,用BCA 法測定蛋白濃度,經非連續梯度SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白,將凝膠上的蛋白轉移至硝酸纖維膜上置于封閉液中,室溫溫育1 h,再加入一抗,Ⅰ型膠原蛋白抗體、Ⅲ型膠原蛋白抗體、4 ℃冰箱搖床上過夜,應用洗液漂洗,再加入二抗,室溫搖床上培育1 h,然后用洗液漂洗。最后將顯色劑加入硝酸纖維膜上,1 min 后放入暗室曝光。經軟件分析。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 DCM動物模型的建立

DCM動物模型冠脈造影及藥物注射過程如圖1所示。

注:冠脈造影確定左冠狀動脈開口位置,自左冠脈動脈主干注射多柔比星(實驗組)或者等量的0.9%氯化鈉溶液(對照組)

2.2 DCM動物模型的評價結果

2.2.1心臟超聲及血液動力學檢測結果:如圖2所示,與對照組相比,實驗組在建模后左房內徑(LA)、左室舒張末內徑(LVEDD)、左室收縮末內徑(LVESD)、室間隔厚度(IVSD)均出現明顯增大(P<0.05);每搏輸出量(SV)、左室射血分數(EF)、左室短軸縮短率(FS)、左室收縮壓(LVSP)、左室舒張末壓(LVEDP)、左室內壓最大上升/下降速度(dp/dtmax)均出現明顯降低(P<0.05),詳見表1。

表1 末次注射4周后心臟超聲檢測結果

注:A～C.對照組,D～F.模型組,與對照組相比,模型組左室射血分數(EF)、左室短軸縮短率(FS)等出現明顯降低,左房內徑(LA)、左室舒張末內徑(LVEDD)、左室收縮末內徑(LVESD)等出現明顯擴大

2.2.2血液學檢測結果:血液學檢測結果顯示:與對照組相比,除白細胞計數外,其余各項指標,DCM組建模后均出現明顯差異(P<0.05),詳見表2。

表2 末次注射4周后血液學檢測結果

2.3 心室重構評價結果

2.3.1組織病理學纖維化程度檢測:如圖3所示,實驗動物取材后進行實驗標本的大體觀察:與對照組相比,實驗組各組實驗動物均出現了不同程度的心臟擴大,部分實驗動物出現左心耳陳舊性血栓,左房出現明顯擴張,心房肌菲薄,左心室內壁出現部分纖維增生。

注:A.DCM組標本大體觀;B.DCM組左心房:左房出現明顯擴大,左房心肌菲薄;C.DCM組左心耳:左心耳出現陳舊性血栓;D.DCM組左心室:心室擴大,出現部分纖維結構樣增生

如圖4所示,實驗動物取材后進行常規HE染色和Masson染色:與對照組相比,實驗組可見明顯的結構損傷,例如:心肌斷裂等結構損傷。與對照組相比,實驗組心肌纖維化程度明顯增加(P<0.05)。

注:A.對照組HE染色;B.實驗組HE染色;C.對照組Masson染色;D.實驗組Masson染色;E.與對照組相比,實驗組出現明顯的纖維化,*P<0.05

2.3.2免疫組化組織Collagen I/III結果:如圖5所示,實驗動物取材后對心肌組織進行Collagen I/III的定量檢測,與對照組相比,DCM組心肌組織內的Collagen I/III含量明顯升高,說明DCM組的心肌纖維化程度明顯升高(P<0.05)。

*P<0.05

3 討論

擴張型心肌病,其病因較復雜,且目前臨床上仍缺少有效治療方法,患者愈后較差。因此建立理想的動物模型,模擬人類 DCM 的病理變化及病情發展,對于DCM 的發病機制、治療效果等臨床研究非常重要。

擴張型心肌病的建模方法較多,有通過轉基因的技術實現的,例如把cTnTR14IW基因克隆入心臟特異表達的 c-MHC 啟動子下游,構建轉基因表達載體[9];也有研究[10]用同種方法成功構建cTnCi59轉基因小鼠模型。與cTnTR141W轉基因小鼠模型相比,該模型發病時間較晚,12月齡時才出現明顯表現,且無猝死發生,故可作為老年發病的 DCM 模型;另外還可以通過自身免疫性缺陷來實現,例如將7周齡 SPF 級雄性Lewis大鼠,隨機分為模型組和正常對照組。DCM組將10 mg/mL的豬心肌球蛋白與等體積的弗氏完全佐劑(含有結核分支桿菌H37Ral mg/mL)進行充分乳化后,在實驗第1天和第8天在大鼠左右后肢足墊皮下各注射上述乳化液0.1 mL。結果顯示:DCM組大鼠均出現足部潰瘍,且心腔擴大,心室壁回聲增強、運動減弱,甚至出現矛盾運動;心肌細胞變性、肥大,局灶性壞死,心肌間質膠原纖維增生等DCM表現[11];還有利用柯薩奇病毒進行的建模實驗,例如采用4周齡小鼠,腹腔內注射0.1 mL 10-柯薩奇病毒,以后每4周腹腔內重復接種,結果顯示:心臟彩色超聲心動圖檢測病毒組小鼠心腔普遍擴大,呈普大心型,心室壁活動度明顯減弱。組織病理學特征與人類擴張型心肌病的病理形態特征極為相似[12];還有利用呋喃唑酮建立DCM模型的方法將哺乳至2周齡的近交系SD 大鼠隨機分為呋喃唑酮組和對照組。將呋喃唑酮配成43 mg/mL的溶液,按0.3 mg/g體質量,下胃管喂飼,每日1次,每周按體質量調整用藥劑量,喂飼8周。實驗結果顯示:DCM 模型不僅出現與人類相同的活體形態學改變、組織病理改變而且具有相同的神經內分泌變化[13]。

DCM 造模方法多種多樣,但是以小動物模型居多,大動物模型建模周期較長,或者建模方法較復雜,均一性較差。目前國內仍缺乏DCM大動物模型建立與評估的相關報道。

有研究[14]將出生4周的雌性SD大鼠,隨機分成實驗組和對照組。實驗組給予多柔比星腹腔內注射,每周2 mg/kg ,連續8周。對照組腹腔內注射與實驗組等量的0.9%氯化鈉溶液,每周1次,連續8周。大鼠在用藥第9周時麻醉,進行超聲心動圖檢查及心肌組織切片。結果顯示,實驗組3只大鼠出現心包積液,均有不同程度的心腔擴張和射血分數下降,心肌細胞變性、壞死,并有明顯心肌間質纖維化。還有學者[15]采用短期3周大劑量腹腔注射多柔比星(15 mg/kg)的方法成功建立了 DCM 模型,但死亡率較高,發病較急,與DCM 慢性發展過程不相符合。利用多柔比星建立小動物模型的報道較多,但是目前仍缺少DCM大動物模型的建模經驗與方法[16-18]。

本實驗旨在探索建立犬的DCM動物模型,通過冠脈造影確定左冠狀動脈主干開口,予以多次冠脈注射多柔比星,每周一次,連續注射5周,末次注射4周后予以取材評估。實驗結果顯示:與對照組相比,DCM動物模型組出現了明顯的全心擴大,且心肌收縮力出現明顯的降低;血液學檢查顯示DCM動物模型組內環境出現了紊亂,其肝、腎功能的各項指標均出現了明顯的升高,血色素、血小板出現了明顯降低;動物取材時發現其心臟出現擴大,部分實驗動物左心耳可見血栓,病理學檢測及Collagen I/III的定量檢測發現,DCM動物模型組出現了明顯的心肌纖維化,心室重構較對照組明顯加重。

擴張型心肌病動物模型的建立常使用阿霉素藥物建模,既往研究中小動物模型較多,如小鼠或者大鼠,大動物模型建模較少,如犬或者豬。阿霉素具有毒性反應,其建立擴張型心肌病的動物模型會產生全身毒性反應,如肝、腎毒性損傷,所以在大動物模型建立時我們選擇了冠脈給藥,藥物由冠脈注射,可以最大程度的降低全身反應情況,加重心肌毒性反應,進而完成擴張型心肌病建模。但即便是冠脈給藥也會出現肝、腎毒性,其無法避免阿霉素的全身毒性反應。目前在國內外相關研究中,擴張型心肌病小動物模型冠脈給藥困難,所以仍選擇外周靜脈或者是腹腔內注射給藥。本次建模選擇了阿霉素冠脈給藥途徑,其建模效果良好,成功建立擴張型心肌病模型。因阿霉素冠脈給藥建模效果良好,故未再設立外周靜脈或者腹腔內注射的建模模型組,后期我們將進一步探究模型的相關建立方法,并進一步對比分析其建模效果。

采用冠脈多次注射阿霉素(多柔比星)的方法建造DCM動物模型,具有可行性及有效性,其周期較短、簡單易行,并且更接近于人類 DCM 病理生理過程。