嚙齒類實驗動物唐菖蒲伯克霍爾德菌熒光定量PCR方法的建立及應用

申屠芬琴 劉 敏 王雪妹 王吉星 彭 剛 吳石愛 李艷楠 周 倩 張巧稚 韓 雪

(北京維通利華實驗動物技術有限公司,北京 100107)

唐菖蒲伯克霍爾德菌(B.gladioli)是一種植物病原菌,屬革蘭陰性桿狀細菌,條件性致病菌。這種菌廣泛存在于土壤、水和植物中[1]。主要危害是污染食品產生毒素,導致食物中毒[2-3],在實驗動物上的報道較少。2004年有文獻[4]報道了B.gladioli引起的免疫缺陷鼠中耳炎暴發,2019年有文獻[1]報道了因B.gladioli污染飲用水導致免疫缺陷小鼠頭部傾斜。感染了唐菖蒲伯克霍爾德菌的免疫缺陷鼠通常引發中耳炎,臨床表現為頭部傾斜、被抓住尾巴時盤旋等,大體病變主要為耳道內產生膿性物質[4]。GB 4789.29—2020描述了對食品中唐菖蒲伯克霍爾德菌的培養和鑒定方法,但步驟多耗時長。因此,建立和使用唐菖蒲伯克霍爾德菌熒光PCR檢測方法,對唐菖蒲伯克霍爾德菌進行快速檢測和鑒定,滿足實驗動物質量檢測的需求非常必要。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1主要試劑:唐菖蒲伯克霍爾德菌(編號10574)(CICC);金黃色葡萄球菌(編號26003-505)和綠膿桿菌(編號10107-3)(中國食品藥品檢定研究院);產酸克雷伯桿菌(編號700324)和嗜肺巴斯德桿菌(編號13669)(ATCC);肺炎克雷伯桿菌(編號46108-5)(CMCC)。110只SPF小鼠,為國內不同設施送檢,包含BALB/C、FVB、C57BL/6N、BALB/c Nude、NOD SCID、NU NU、NOG等品系。唐菖蒲伯克霍爾德菌引物、探針和質粒,由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。MagMAXTMTotal Nucleic Acid Isolation Kit和TaqManTMGene Expression Master Mix(ABI公司)。

1.1.2主要儀器:7500熒光定量PCR儀(ABI公司);KingFisher全自動核酸提取儀(ThermoFisher公司);Heal fore2級生物安全柜(力康生物醫療科技控股有限公司)。

1.2 方法

1.2.1引物、探針和質粒的合成:參考團標T/SATA 023—2021《唐菖蒲伯克霍爾德氏菌及米酵菌酸產毒株檢測方法實時熒光PCR 法》序列(表1),由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

表1 唐菖蒲引物和探針序列

1.2.2質粒標準品的制備:用無核酸酶水溶解合成的唐菖蒲伯克霍爾德菌質粒干粉,并按1∶10稀釋成1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102和1×101copies/5 μL,編號為S1～S7。

1.2.3熒光PCR體系的建立:將提取的DNA作為模板,進行熒光PCR擴增檢測。反應體系為:唐菖蒲伯克霍爾德菌上游引物、下游引物和探針各1 μL,Master Mix 10 μL,無核酸酶水2 μL,提取的DNA模板5 μL,合計共20 μL。反應程序:第一階段 50 ℃ 2 min,95 ℃ 10 min;第二階段 95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,40個循環;60 ℃采集信號。

1.2.4線性實驗:檢測S1～S7 7個濃度梯度的線性化質粒DNA標準品,繪制標準曲線,要求線性相關系數R2≥0.99。

1.2.5靈敏度和重復性實驗:檢測S1～S7 7個濃度梯度的線性化質粒DNA標準品,每個濃度做3個重復,統計結果,檢驗方法靈敏度和重復性。

1.2.6特異性實驗:將唐菖蒲伯克霍爾德菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯桿菌、產酸克雷伯桿菌、綠膿桿菌和嗜肺巴斯德桿菌等6個菌株進行復蘇和培養,挑取單菌落,加入200 μL PBS 混勻。使用KingFisher全自動核酸提取儀提取核酸作為模板,用本方法進行檢測,檢驗方法特異性。

1.2.7本方法的結果判定:Ct值≥40,可判定樣品結果為陰性;Ct值≤35,可判定樣品結果為陽性;35< Ct值<40,為樣本疑似,需將樣品重新檢測。若重測的結果Ct值≥40則判為陰性,否則判為陽性。

1.2.8本方法的應用及與細菌培養法的比對:將送檢的110只活體小鼠進行安樂死后采集口咽部樣品,同時用本方法以及GB 4789.29—2020細菌培養法進行檢測,比較兩種方法檢測結果。

2 結果

2.1 線性實驗結果

在反應孔中分別加入S1～S7 7個樣本及配置好的PCR混合液,進行擴增反應。以基因的Ct值為縱坐標,樣本濃度為橫坐標,繪制標準曲線(圖1),線性相關系數R2=0.998,本方法線性良好。

圖1 標準曲線

2.2 靈敏度和重復性實驗結果

將S1～S7 7個濃度梯度的線性化質粒DNA標準品重復檢測3次,擴增曲線見圖2。質粒DNA濃度1×107～1×102copies/5 μL(S1～S6)均為陽性,即方法靈敏度可達1×102copies/5 μL。計算每個濃度重復檢測的CV值(表1),可見各濃度重復3孔CV值<2%,方法重復性良好。

圖2 質粒DNA標準品擴增曲線

2.3 特異性實驗結果

用本方法同時檢測培養的唐菖蒲伯克霍爾德菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯桿菌、產酸克雷伯桿菌、綠膿桿菌和嗜肺巴斯德桿菌的菌液。結果除唐菖蒲伯克霍爾德菌外,其余菌液均為陰性。擴增曲線見圖3,僅唐菖蒲伯克霍爾德菌陽性菌株有明顯擴增,方法特異性良好。

圖3 特異性實驗

2.4 本方法的應用及與細菌培養方法的比對結果

采集110只活體小鼠口咽部樣品,用本方法檢測,結果110份樣品及陰性對照均沒有擴增,陽性對照有明顯擴增(圖4)。同時用細菌培養法對此110份小鼠樣品進行檢測,結果為陰性。2種方法檢測結果完全符合。

3 討論

唐菖蒲伯克霍爾德菌是一種條件致病菌,致病因素包括免疫抑制和/或補體缺乏[4]。隨著科技的發展,免疫缺陷鼠被越來越多的用于現代生物醫學研究,這類實驗動物對唐菖蒲伯克霍爾德菌易感,感染后引起中耳炎暴發,對科學研究造成干擾和損失。建立檢測唐菖蒲伯克霍爾德菌的方法,可滿足生產商和使用者對于實驗動物質量在這方面的需求。

在食品領域,對于唐菖蒲伯克霍爾德菌已建立了多種鑒定方法,如培養法和VITEK生理生化鑒定、MALDI-TOF-MS和recA序列分析法、實時熒光PCR檢測技術等[5-7],可供實驗動物領域借鑒。培養法是最經典的方法,但所需時間長;質譜方法鑒定耗時短且準確性高,但儀器價格昂貴;分子生物學方法準確性好,檢測時間短,價格遠低于質譜法,從適用性和實效性來說更適合用于實驗動物的檢測。

本文建立的熒光PCR方法線性良好,線性相關系數R2=0.998;靈敏度高,最低可檢測到1×102copies/5 μL;重復性好,CV<2%;特異性強,除唐菖蒲伯克霍爾德菌外其他幾種菌均為陰性。方法各項性能良好,實際送檢樣品檢測結果與培養法一致,可用于實驗動物唐菖蒲伯克霍爾德菌的檢測,為實驗動物的質量監測提供了技術支持。