PD-1人源化小鼠構建繁殖與基因型鑒定*

李曉娟 孫巖峰 修 葉 李興杰 李瑞生

(1.中國人民解放軍總醫院第五醫學中心感染病醫學部研究所,北京 100039)(2.中國人民解放軍總醫院第三醫學中心兒科,北京 100039)(3.中國人民解放軍總醫院第五醫學中心肝病醫學部研究所,北京 100039)(4.福建中醫藥大學藥學院,福州 350122)

近年來惡性腫瘤的發病率呈持續增長趨勢已成為嚴重的社會問題[1]。隨著研究的不斷突破,以PD-1/PD-L1為靶點的腫瘤免疫治療成為熱點,通過抑制PD-1/PD-L1通路,從而恢復機體免疫功能并產生抗腫瘤作用[2]。眾所周知,動物模型在實驗研究中擔負起不可取代的重要作用,研究者多通過基因修飾的技術,將小鼠體內的相關基因替換成人的相關基因從而建立人源化小鼠模型,能夠更好的在動物模型中模擬人類疾病并進行研究,此類人源化小鼠廣泛應用于腫瘤免疫藥物研發、藥物臨床前評估、人基因功能研究等生物醫藥領域研究[3-5]。本實驗擬采用CRISPR/Cas9基因組編輯技術來構建PD-1人源化小鼠,為進一步開發和應用PD-1人源化小鼠(h-PD-1)作為藥物篩選及評價來提供良好的動物模型。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物:本實驗委托賽業模式生物研究中心(太倉)有限公司,實驗動物生產許可證號【SCXK(蘇)2018-0003】。采用CRISPR/Cas9基因組編輯技術,將C57BL/6J小鼠中PD-1的胞外區替換為相應的人源片段,同時完整保留小鼠PD-1的胞內部分,將構建好的受精卵通過顯微注射法送回到代孕鼠輸卵管中,最終獲得陽性F0鼠。對F0鼠進行配繁,將性成熟的陽性F0鼠與野生型鼠配繁一代,獲得F1代鼠,并經鼠尾基因組DNA的PCR檢測PD-1的基因表達。因此公司提供了4只SPF級F1代小鼠,其中2只雌性和2只雄性,品系:C57BL/6J,基因型(KI/+),體質量20～24 g,8～9周齡。

1.1.2人源化小鼠的飼養與繁殖:將獲得的4只F1代小鼠按照SPF級實驗動物標準飼養,采用1(雄鼠)∶1(雌鼠)配比的方式進行繁殖。動物飼養在解放軍總醫院第五醫學中心動物實驗中心【SYXK(軍)2017-0016】,屏障環境按國家標準進行飼養管理,飼料墊料購自斯貝福(北京)生物技術有限公司【SCXK(京)2019-0010】。本實驗嚴格按實驗動物使用的3R原則給予人道的關懷,通過了解放軍總醫院第五醫學中心動物倫理委員會審查,倫理審批號:IACUC-2021-0020。

1.1.3主要試劑與儀器:小鼠基因型快速鑒定試劑盒(北京陽光英銳生物科技有限公司,貨號:C190801);上樣緩沖液&DNA染料(即用型)(北京陽光英銳生物科技有限公司,貨號:C081911);50 bp DNA Ladder(北京金克隆生物技術有限公司,貨號:MD0050);PCR擴增儀(PeQlab,型號:PEQSTAR 2X)。

1.2 方法

1.2.1小鼠基因組DNA提取:將獲得的F1代飼養繁殖的F2代小鼠雌雄分籠后,分別剪取小鼠尾部一小段(0.2～0.5 cm)置入1.5 mL Eppendorf管中,參照小鼠基因型快速鑒定試劑盒抽提基因組DNA。

1.2.2PCR反應及瓊脂糖凝膠電泳基因型鑒定:兩組引物設計:(1)野生型:上游引物:5′-TTCCTTTCCGCTACAGACAACTC-3′,下游引物:5′-CTTCACAGAGAGGGACACAGAAGA-3′;(2)純合子:上游引物:5′-GAATGGTGACCGGCATCTCTG-3′,下游引物:5′-GCTTTTGTAGTGGTCAGAGTGTGT-3′。PCR 反應:下列反應物構成20 L的反應體系。上游引物0.5 μL,下游引物0.5 μL,2×Hot Taq Mix 10 μL,DNA 模板(Diluted Template)2 μL,加H2O補足20 μL。采用基因擴增儀進行循環擴增:預變性,95 ℃ 5 min;變性,95 ℃ 30 s;退火,55 ℃ 30 s;延伸,72 ℃ 1 min,共35個循環,最后再延伸10 min。電泳鑒定:分別取PCR擴增產物10 μL,在2.0%瓊脂糖凝膠中以120 V電泳30 min后于凝膠成像儀中觀察拍照。小鼠尾部組織瓊脂糖凝膠電泳基因型片段為:野生型:434 bp;純合型:410 bp;雜合型:434 和410 bp,按此基因條帶鑒別各個基因型小鼠。

1.2.3繁育與純合型小鼠篩選鑒定:對F2代小鼠進行基因型鑒定,分別記錄各基因型數量以及純合型數量,計算純合率。然后采用經典育種與PCR相結合的方法對基因敲除小鼠純合型再次進行篩選。出生21 d后仔鼠行PCR檢測,選出純合型小鼠。成年F2代純合型與純合型、野生型與野生型進行交配,對繁殖的F3代仔鼠再進行基因型鑒定,確定基因型的穩定性后,繼續將純合型小鼠穩定擴群。

2 結果

2.1 人源化小鼠F2代配繁及生長情況

截至目前,F2代小鼠共繁殖5窩,每窩成活率均>95%。母鼠孕期為21 d左右,幼鼠由母鼠母乳喂養,哺乳期 21 d 左右,產后3周離乳。隨著產仔窩數的增加,仔鼠的數量逐漸減少,母鼠的生育能力呈逐漸降低的狀態。前4窩仔鼠雄性數量均比雌性數量多(表1)。

表1 F2代繁育結果統計

2.2 人源化小鼠F2代基因鑒定結果

將人源化小鼠出生21 d的F2代小鼠進行編號,部分小鼠鼠尾基因組DNA擴增產物凝膠電泳結果見圖1。根據僅在410 bp左右位置可見條帶為PD-1人源化小鼠純合型,僅434 bp位置可見條帶為野生型,在410和434 bp位置同時存在條帶的小鼠為雜合型的判斷原則,圖中1號、4號、7號為純合型小鼠;2號、5號為雜合型小鼠;3號、6號、8號為野生型小鼠。

注:M.marker, 1～8分別為8只F2代小鼠

2.3 F2代交配繁育的F3代鑒定結果

根據PCR鑒定結果,將F2代中鑒定的雜合型與雜合型,純合型與純合型小鼠按雌雄1∶1的比例進行配繁。將純合型交配繁殖的F3代小鼠用上述相同的方法進行鑒定,條帶均為410 bp,說明均為純合型,符合鑒定結果(圖2),可繼續進行繁殖擴群。純合型與野生型小鼠外觀上未見明顯差異(圖3)。

注:M.marker, 1～4分別為4只F3代純合型小鼠

注:A.腹部對比圖;B.背部對比圖

3 討論

基因工程動物模型在生物醫學研究中是非常重要的研究載體,由于小鼠體型小,方便實驗操作,又易于飼養繁殖,價格便宜,因此成為了基因工程動物模型的首選[6]。研究者可以對新出現的熱點基因敲入各種品系的小鼠體內,以便進行不同疾病信號通路的研究。有研究[7]穩定的繁殖了AMPKα2基因敲除小鼠純合子,為以后在糖尿病研究中提供了很好的動物平臺;有研究[8]成功構建了前列腺癌免疫人源化小鼠模型,為下一步構建良好的前列腺癌免疫治療臨床前模型奠定了基礎;有研究[9]構建PD-L1基因敲除小鼠品系,為 PD-L1體內基因功能研究提供了新的小鼠模型。而有關PD-1的基因工程小鼠報道甚少,人源化PD-1的基因型小鼠尚未見報道。

因此,本實驗采用CRISPR/Cas9基因組編輯技術,將C57BL/6J小鼠中PD-1的胞外區替換為相應的人源片段,同時完整保留小鼠PD-1的胞內部分,將構建好的受精卵通過輸卵管胚胎移植法送回代孕鼠輸卵管中,獲得陽性F0鼠。再將性成熟的陽性F0鼠與野生型鼠配繁一代,獲得F1代鼠,并經鼠尾基因組DNA的PCR鑒定小鼠的基因型。本實驗室把F1代進行交配獲得F2代仔鼠,共繁殖5窩,分別記錄了每窩的生仔數、基因型數以及純合率。根據孟德爾遺傳定律,采用雜合子互交,子代小鼠可能出現野生型(PD-1+/+)、雜合子(PD-1+/-)和純合子(PD-1-/-)3種基因型,其比例接近1∶2∶1,本實驗結果顯示除第5窩外,前4窩均雜合型數量最多,野生型與純合型數量較少且接近,三者比例接近1∶2∶1,因此符合孟德爾遺傳定律的特征。隨后實驗中的雜合型小鼠可用于保種,而野生型小鼠可用于實驗陰性對照組,該繁育方法同時滿足了實驗與保種的需求[10]。隨著繁殖窩數的增多,F1代鼠的產仔數逐漸減少,說明其生育能力逐漸降低,因此實驗要盡快開展,將F2代鼠鑒定完畢后,盡快繁殖下一代,確保純合型得到穩定擴群。由于PD-1人源化小鼠的各基因型從外觀上很難區分,因此從基因水平進行鑒定是實驗的首要任務。眾所周知,PCR法是非常成熟且廣泛應用的鑒定基因型的方法,我們設計了分別針對野生型與純合型的兩對特異性引物,能夠增加鑒定不同基因型的準確性和可靠性[11]。根據PCR的鑒定結果,我們嚴格按照SPF級動物飼養標準對小鼠進行飼養和繁殖[12],在子代中挑選幾對雜合型與雜合型配繁保持種群穩定性,其余挑選純合型與純合型再進行繁育,結果其F3代仔鼠全部為純合型,而且后續再生的兩窩仔鼠基因型鑒定也均為純合型,說明其基因型保存完整。同時觀察發現PD-1人源化小鼠純合型配繁后的懷孕率及生仔數均不低,我們知道在小鼠繁殖過程中噪音對繁殖也起到關鍵的影響作用,如果噪音過大或者來往人員過密,就會造成母鼠煩躁不哺乳,進而引起仔鼠死亡,同時多項研究結果也顯示各種基因工程小鼠都存在食仔現象[13]。因此每天進行觀察的時候要盡量保持安靜,再給予蛋黃等營養食物,能夠明顯的緩解食仔現象[14],這樣可明顯提高母鼠的產仔率和仔鼠的成活率,為下一步實驗研究提供良好的動物保障。

綜上所述,本實驗應用CRISPR/Cas9基因組編輯技術,所構建的PD-1人源化小鼠動物模型,在免疫檢查點抑制劑研究中具有獨特的研究價值,通過對其基因型鑒定并有效地進行了擴群,為今后相關小分子抑制劑體內藥效評價實驗提供有力的保障。