基于Nrf2/HO-1信號通路研究黛玉膏對肛瘺大鼠血管生成的影響*

郭 偉 閆麗霞 常少青 劉振麗

(1.保定市第二醫院 肛腸科,保定 071050)(2.河北省第七醫院 影像科,保定 073000)

肛瘺是指直腸或肛管與肛周皮膚相通所形成的異常通道,中醫稱為“肛漏”“痔漏”“穿腸漏”等,為常見肛腸疾病,患病率為8.6/105例[1]。肛瘺治療以手術為主,但術后存在疼痛劇烈、創面愈合緩慢等問題[2]。中醫藥外用在肛瘺治療中具有獨特優勢[3]。黛玉膏針對肛瘺濕熱郁結而致癰潰不愈的病機而設,能夠收濕斂瘡、生肌止血,臨床研究表明其能縮短創面愈合時間,減輕術后并發癥,可能與提高創面血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)水平有關[4]。為進一步明確其作用靶點,本研究通過建立大鼠模型,深入探討其干預的信號通路,為臨床應用提供新的依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物:10周齡雄性SPF級SD大鼠(200±20)g共30只,購于北京維通利華實驗動物技術有限公司,生產許可證號【SCXK(京)2021-0011】,使用許可證號【SYXK(京)2017-0023】。適應性飼養5 d,室溫(22±2)℃,采用12 h∶12 h晝夜間斷照明,自由飲食飲水。本實驗已通過保定市第二醫院福利倫理審查,審查編號:IACUC-20210307-12。

1.1.2主要試劑和儀器:黛玉膏(由保定市第二醫院藥劑科加工制備,組成成分:煅爐甘石7.5 g,煅石膏107.5 g,赤石脂7.5 g,青黛50 g,滑石100 g,黃柏50 g,藥物混合充分研磨成粉,過100目篩2次,加入麻油調成膏劑備用);大鼠VEGF ELISA檢測試劑盒、大鼠血管VEGFR ELISA檢測試劑盒(上海將來實業股份有限公司)、大鼠血小板衍生生長因子(platelet derived growth factor,PDGF)ELISA檢測試劑盒(北京諾為生物技術有限公司)、大鼠表皮細胞生長因子(epidermal growth factor,EGF)ELISA檢測試劑盒、大鼠白細胞介素(interleukin,IL)-1β ELISA檢測試劑盒、大鼠IL-6 ELISA檢測試劑盒、大鼠IL-10 ELISA檢測試劑盒、大鼠腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)ELISA檢測試劑盒(均碧云天生物技術研究所)、兔抗核因子2相關因子2(nuclear factor erythroiD-2-related factor 2,Nrf2)一抗(ab137550)、兔抗血紅素氧合酶1(heme oxygenase-1,HO-1)一抗(ab52947)、兔抗CD31一抗(ab182981)、兔抗β-actin一抗(ab8227),試劑購自艾博抗(上海)貿易有限公司。

PeriFlux 5000型激光多普勒血流儀(深圳市瑞沃德生命科技有限公司);5804R高速冷凍離心機(德國艾本德股份公司);奧林巴斯生物顯微鏡 OLYMPUS BX43(日本奧林巴斯株式會社);BioTek ELx808酶標儀(美國伯騰儀器有限公司);164505電泳系統、ChemiDoc XRS+化學發光成像系統(伯樂公司)。

1.2 方法

1.2.1大鼠肛瘺模型的建立及分組:采用綜合法構建肛瘺術后創面大鼠模型[5-6],術前備皮,5% 戊巴比妥鈉(戊巴比妥40 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠,肛門部手術區備皮消毒,采用創傷制作器在脊柱旁側0.5 cm處切割直徑約為1.8 cm的圓形創口,且肌層傷口深度約為0.3 cm,止血后在創面上加糞液1 mL,固定(油紗、敷料、膠帶),48 h后去除覆蓋物,若見傷口有膿性分泌物與糞臭味出現,表示造模成功。將成功建立的20只肛瘺術后創面大鼠,根據隨機數字表,按大鼠體質量隨機分為模型組(n=10)及黛玉膏組(n=10);另選擇10只僅造成創口后不敷以糞液作為對照組。黛玉膏組大鼠使用藥物涂抹傷口,對照組和模型組以0.9%氯化鈉溶液擦洗,紗布包扎傷口,每天2次。造模成功后當天開始治療,各組大鼠均連續干預14 d,后以過量麻醉藥注射處死,收集創面組織用以后續實驗。

1.2.2創面愈合情況及局部血流監測:于第3天藥物干預結束后,采用透明格子膠片測量局部創面面積,創面愈合率=【原始創面面積(術后3 d)-當前創面面積藥物干預結束】/原始創面面積術后3 d×100%[7]。應用激光多普勒血流儀,所有大鼠均記錄隨機3處創面血流情況,并經Power Lab Chart數據采集分析系統計算3處創面血流取均值進行分析。

1.2.3HE染色:中性多聚甲醛固定創面組織,并用石蠟包埋,乙醇梯度脫水,二甲苯透明、浸蠟、包埋、切片。將切片進行粘片、烤片,脫蠟,梯度乙醇復水后進行抗原修復。用CD31抗體染色(1∶300)。封片后光學顯微鏡下觀察陽性染色。

1.2.4ELISA操作步驟:取肛瘺創面組織勻漿檢測VEGF、VEGFR、EGF、PDGF、IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α水平,嚴格按照說明書操作,將標準品按照說明書操作方法梯度稀釋后,另取待測樣品孔加樣50 μL并設空白孔,后于每孔加入酶標試劑50 μL(空白孔除外),封板膜封板并置37 ℃恒溫箱溫育60 min,每孔加滿洗滌液靜置15 s棄去,重復5次,先后加入顯色劑A、B各50 μL,37 ℃避光顯色15 min,加終止液 50 μL,450 nm 波長依序測量各孔的吸光度并進行濃度計算。

1.2.5Western blot法檢測Nrf2及HO-1表達水平:采用Western blot法檢測創面組織Nrf2及HO-1蛋白水平。使用RIPA高效組織裂解液提取總蛋白,BCA法測定蛋白濃度并加入5×SDS蛋白上樣緩沖液(按1∶4的比例)煮沸后備用。每孔加入40 μg樣品或3 μL Marker進行電泳,濃縮膠電壓90 V,20 min,分離膠電壓120 V,45 min,電泳后轉膜,3%BSA(體積分數0.5%TBST)封閉1 h。孵育一抗,分別用Nrf2兔單克隆抗體(1∶1 500)、HO-1兔單克隆抗體(1∶1 500),β-actin兔單克隆抗體(1∶2 000),4 ℃孵育過夜,后以TBST洗3次。山羊抗兔IgG(1∶5 000)室溫下孵育1 h后,TBST洗3次,每次5 min。ECL曝光顯影,Image J圖像處理軟件分析結果。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 各組大鼠的創面愈合率比較

與對照組相比,模型組和黛玉膏組的創面愈合率顯著下降(P<0.05);與模型組相比,黛玉膏組大鼠創面愈合率顯著升高(P<0.05);與對照組比較,模型組和黛玉膏組顯著下降,而黛玉膏組較模型組顯著升高(P<0.05)(表1)。

表1 各組大鼠的創面恢復情況比較

2.2 各組大鼠創面CD31陽性率比較

CD31免疫組化染色結果顯示(圖1),與對照組比較,模型組肉芽組織CD31染色陽性面積顯著降低,差異具有統計學意義(P<0.05);與模型組相比,黛玉膏組大鼠肉芽組織,CD31染色陽性面積顯著升高,差異具有統計學意義(P<0.05)。

注:與對照組相比,*P<0.05;與模型組相比,#P<0.05

2.3 各組大鼠肉芽組織炎性因子水平比較

與對照組比較,模型組和黛玉膏組大鼠肉芽組織IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α水平均顯著增高,差異具有統計學意義(P<0.05);與模型組相比,黛玉膏組大鼠肉芽組織IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α水平均顯著下降,差異具有統計學意義(P<0.05),見表2。

表2 各組大鼠肉芽組織炎性因子水平比較

2.4 各組大鼠肉芽組織血管生成調控因子水平

與對照組比較,模型組肉芽組織VEGF、VEGFR、EGF、PDGF水平均顯著降低,差異具有統計學意義(P<0.05);與模型組和對照組相比,黛玉膏組大鼠肉芽組織VEGF、EGF、PDGF水平均顯著增高,差異具有統計學意義(P<0.05);與模型組相比,黛玉膏組大鼠肉芽組織VEGFR顯著增高(P<0.05),見表3。

表3 各組大鼠肉芽組織血管生成調控因子水平比較

2.5 各組大鼠創面組織Nrf2、HO-1蛋白的表達水平比較

與對照組相比,模型組的Nrf2、HO-1蛋白顯著降低(P<0.05);與模型組和對照組相比,黛玉膏組大鼠創面組織Nrf2、HO-1蛋白的表達水平均顯著升高,差異具有統計學意義(P<0.05),見圖2。

注:與對照組比較,#P<0.05;與模型組比較,*P<0.05

3 討論

肛管直腸瘺,簡稱肛瘺,為肛管或直腸腔與肛門外皮膚相通的一種異常管道,中醫亦稱“痔漏”“漏瘡”“單漏”[8]。瘺最早見于《素問·生氣通天論篇》:“陷脈為瘺,留連肉腠”。《醫宗金鑒·外科心法要訣·痔瘡篇》釋曰“破潰而出膿血,黃水浸淫,淋漓久不止者,為漏”。肛瘺一般由內口、瘺管和外口三部分組成,也有只有內口或外口者[9]。內口多為原發性,多數位于肛竇內。外口是繼發的,在肛門周圍皮膚上,口不只一個[10]。其特征為瘺管內口多位于肛竇內,管道穿過肛門直腸周同組織,外口位于肛周皮膚,經常有膿性分泌物由外口流出,每因外口閉合而致局部腫痛,繼而在原外口處或附近重新潰破出膿,如此反復發作,經久不愈[11]。中醫學將肛瘺的病因歸納為肛癰潰后、虛癆久咳、外感六淫、飲食不節、內傷七情、痔久不愈、肛周氣血運行不足,而致毒邪集聚,最終穿腸透穴,敗壞肌肉,消損骨髓,而為之瘺[12]。

黛玉膏針對肛瘺的病機而設,方由煅爐甘石、煅石膏、赤石脂、滑石、青黛、黃柏組成,其中煅爐甘石、煅石膏、滑石、赤石脂性平味甘,入肝、胃經,能夠收濕斂瘡,青黛、黃柏苦寒能夠清熱燥濕解毒;諸藥相合,共奏燥濕解毒、拔腐生新之功[4]。以往的臨床研究表明,黛玉膏外用能夠減輕肛瘺患者術后創面的疼痛,促進創面愈合,其機制可能與增加創面 VEGF 表達、促進創面血管生成和成纖維細胞聚集有關[4]。VEGF 對血管內皮細胞的遷移、擴散、分化具有重要作用,是目前已知的作用最強的促血管生長因子,此外也能促進肉芽生長,加速上皮化[13]。CD31表達于血管內皮細胞,血小板等,是標記組織中血管的經典指標。研究通過建立大鼠肛瘺模型研究發現,使用綜合法造模能成功建立肛瘺模型,而黛玉膏能夠促進創面愈合、減輕創面病理損傷,抑制炎性因子表達而促進血管生成相關因子的表達,提高創傷部分血管數量和血流量。目前,關于黛玉膏發揮創面修復作用的基礎研究較少,但關于其組分的藥理作用已有報道。如煅石膏可以通過水通道蛋白(aquaporin,AQP)升高AQP1、AQP3的表達,促進急性軟組織損傷的修復[14];爐甘石可以促進肉芽組織中的新生毛細血管生成,增加受損創面的血供,加速創面恢復[15];青黛能夠促進皮損和黏膜創傷愈合,近期研究表明其能抑制皮損的炎性細胞浸潤[16];減輕網絡藥理學分析表明,黃柏中的有效成分能夠靶向炎性和血管新生通路相關分子治療創面損傷[17]。以上數據表明使用綜合法造模能成功建立肛瘺模型,而黛玉膏可能通過促進創面局部的血液循環、抑制炎性反應而加速肛瘺的好轉。

創面愈合過程中,肉芽的生長速度和質量是愈合的關鍵[18]。為進一步探索其促進血管新生、增高血流量促進愈合的機制,本研究進一步檢測了Nrf2/HO-1信號通路的表達水平。Nrf2轉錄調控因子,在細胞面對不良環境刺激時可被激活[19]。激活后Nrf2與內源性抑制因子 Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白-1(Kelch-like ECH associated protein1,Keap1)結合,發生核轉位并與抗氧化反應元件(antioxidant response element,ARE)結合,調控下游基因表達[20]。其中HO-1的啟動子區富含ARE區域,是Nrf2下游最重要的基因之一[21]。HO-1是一種可將血紅素降解產生膽綠素、亞鐵離子和一氧化碳的水解酶,大量研究已經報道了HO-1在創傷愈合、腫瘤以及其他疾病中是重要的調控血管新生的因子[22]。如HO敲除小鼠表現出皮膚傷口愈合障礙及血管新生減少[23];類似的,使用小分子化合物抑制HO-1/CO信號可以顯著降低血管新生水平[24]。另外,Nrf2/HO-1信號通路可以上調諸多血管新生因子的表達,如EGF、VEGF和 PDGF[25]。最后,有文獻報道了Nrf2/HO-1與炎性因子的表達密切相關[26]。本研究結果顯示,模型組大鼠創面組織的Nrf2及HO-1的水平較對照組顯著降低,而涂抹黛玉膏后,Nrf2及HO-1的水平升高,表明其可以激活Nrf2/HO-1通路從而發揮促進血管新生的作用。

綜上,本研究結果表明,黛玉膏可以促進肛瘺模型大鼠創面的愈合,促進肉芽組織的血管新生,其機制可能與激活Nrf2/HO-1通路有關。但血管新生涉及多條信號通路,因此黛玉膏的藥理作用還有待進一步研究。