蕨麻豬高原多臟器功能障礙綜合征模型eNOS與ET-1的變化研究*

付曉燕 馮小明 李淵明 肖 攀 王紅義 陸 璐 張 梅 牛廷獻(xiàn)

(1.中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第940醫(yī)院超聲診斷科,蘭州 730050)(2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所,蘭州 730046)(3.中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第940醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室,蘭州 730050)(4.甘肅省中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科, 蘭州 730070)

多臟器功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)具有發(fā)病急、進(jìn)展快、病死率高的特點(diǎn),是危重癥患者最重要的死亡原因之一[1]。我國(guó)高原地區(qū)急性高原病重型并發(fā)MODS的發(fā)病率較高[2-3]。高原多臟器功能障礙綜合征(high altitude multiple organ dysfunction syndrome, H-MODS)雖然在發(fā)病機(jī)制上與平原的并無差異,但由于以缺氧為主高原環(huán)境打擊使其發(fā)病及病程更為復(fù)雜危險(xiǎn)[4]。內(nèi)皮縮血管肽(endothelin, ET-1)和一氧化氮(nitiric oxide,NO)是維持血管舒縮功能、共同保持血管的正常狀態(tài)和功能的重要活性物質(zhì),在正常情況下處于動(dòng)態(tài)平衡[5]。ET-1是人體作用最強(qiáng)的血管收縮劑,主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞合成和分泌,它具有刺激血管平滑肌細(xì)胞增殖的作用[6-7]。NO是機(jī)體內(nèi)自由擴(kuò)散的一種信號(hào)分子,它具有調(diào)節(jié)血管舒張度,并抑制血小板聚集和白細(xì)胞黏附,它是炎性反應(yīng)中的關(guān)鍵介質(zhì),起到保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的作用,一氧化氮合成酶(eNOS)是NO合成的限速酶,其活性的改變將影響NO的生成[8-9]。深入認(rèn)識(shí) ET-1 和 NO 的平衡對(duì)人體微環(huán)境的調(diào)節(jié)及炎性反應(yīng)過程中的變化特點(diǎn),也將有助于揭示H-MODS在炎性反應(yīng)過程中的變化特點(diǎn),這將有助于對(duì)H-MODS的診斷及精準(zhǔn)用藥,提高對(duì)H-MODS病程發(fā)展及致病機(jī)制的認(rèn)識(shí),從而拓寬臨床診治H-MODS的思路和治療水平。

1 材料和方法

1.1 材料

動(dòng)物與試劑:蕨麻豬24只,雌雄各半,體質(zhì)量15 kg左右,分為H-MODS蕨麻豬模型高、中、低劑量組和對(duì)照組,每組6只,按雌雄各半隨機(jī)分組。蕨麻豬為甘南地區(qū)散戶飼養(yǎng)。eNOS與ET-1試劑盒(武漢華美)。氯胺酮(國(guó)藥準(zhǔn)字:H35020148,福建古田藥業(yè)有限公司),地西泮注射液(國(guó)藥準(zhǔn)字:H12020957,天津金耀氨基酸有限公司),內(nèi)毒素(LPS)(血清型為:O127:B8,批號(hào)為64H4010,Sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1模型建立方法:建模方法參照文獻(xiàn)[10-11],本實(shí)驗(yàn)在海拔3 500 m的甘南桑科草原進(jìn)行,將豬運(yùn)到實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d,待動(dòng)物狀態(tài)穩(wěn)定后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物麻醉采用氯胺酮(6 mg/kg)聯(lián)合安定(0.5 mg/kg)進(jìn)行肌注麻醉,同時(shí)肌肉注射阿托品(0.05 mg/kg)。動(dòng)物麻醉后經(jīng)耳緣靜脈泵入脂多糖(lipopolysaccharides, LPS),每組泵入時(shí)間均控制在30 min左右,低、中、高劑量組分別按0.25 mg/kg(B組)、0.35 mg/kg(C組)、0.5 mg/kg(D組),對(duì)照組(A組)以等量的0.9%氯化鈉溶液代替。

1.2.2MODS的診斷標(biāo)準(zhǔn):按參照文獻(xiàn)[10]提出的動(dòng)物發(fā)生MODS時(shí)各個(gè)器官功能障礙分期診斷標(biāo)準(zhǔn)和評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)。在注射LPS后出現(xiàn)2個(gè)或2個(gè)以上器官或系統(tǒng)功能障礙判定為MODS。

1.2.3血清采集:3組分別于泵入LPS后0、3、6、12、24、48 和72 h經(jīng)頸靜脈采血,分離血清存于-80 ℃待檢測(cè)。

1.2.4ELISA檢測(cè)指標(biāo):eNOS與ET-1表達(dá)水平由本實(shí)驗(yàn)室參照試劑盒操作說明進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 模型建立結(jié)果

中、高、低各劑量組豬經(jīng)麻醉輸入LPS 1 h后,各組豬均有倒臥昏睡狀態(tài),并心率增快,伴隨有腹脹、發(fā)熱、尿頻;蘇醒后四肢無力倒臥,食欲減退,精神萎靡,呼吸急促等表現(xiàn)。低、中劑量組豬1 h后轉(zhuǎn)醒,在8 h后站立行走,開始采食,精神基本恢復(fù)正常;高劑量組在2 h后才慢慢開始轉(zhuǎn)醒,站立行走時(shí)間要比低、中劑量組晚2 h;中劑量組1頭豬在4 h時(shí)發(fā)生呼吸窘迫、心律失常,繼之心臟衰竭死亡。高劑量組豬在3 和5 h時(shí)各有1只豬發(fā)生呼吸窘迫、心律失常,繼之心臟衰竭死亡。低劑量組豬沒有出現(xiàn)死亡,對(duì)照組豬體征表現(xiàn)正常,也無死亡。中劑量組與高劑量組豬死亡率分別為16.7 %和33.3 %。通過研究發(fā)現(xiàn),中、高劑量組豬均出現(xiàn)死亡,都可以成功建立H-MODS模型[12]。

2.2 eNOS的變化

蕨麻豬靜脈泵入LPS后,B、C、D組eNOS表達(dá)量變化趨勢(shì)基本相同,在3 h驟然升至峰值,之后快速下降,至24 h基本恢復(fù)到正常值,對(duì)照組表達(dá)量平穩(wěn),無顯著性變化。B、C、D組eNOS表達(dá)量在3～12 h與0 h和A組相比明顯升高(P<0.01);24～72 h B、C、D組eNOS表達(dá)量基本恢復(fù)到正常值,與0 h和A組相比無明顯差異。eNOS表達(dá)量情況與走勢(shì)詳見表1。

表1 各組豬不同時(shí)點(diǎn)eNOS的表達(dá)量比較

2.3 ET-1的變化

蕨麻豬靜脈泵入LPS后,B、C、D組ET-1表達(dá)量變化趨勢(shì)大致相同,都是在泵入LPS后急劇上升,在3 h升至峰值,之后開始下降,至24 h基本恢復(fù)到正常值,對(duì)照組表達(dá)量在各時(shí)間點(diǎn)無顯著性變化。B、C、D組ET-1表達(dá)量在3～6 h與0 h和A組相比顯著升高(P<0.01);B、C組ET-1表達(dá)量在12與0 h和A組相比明顯升高(P<0.05);D組ET-1表達(dá)量在12 h與A組相比明顯升高(P<0.05);24～72 h B、C、D組ET-1表達(dá)量基本恢復(fù)到正常值,與0 h和A組相比無明顯差異。ET-1表達(dá)量情況與走勢(shì)詳見表2。

表2 各組豬不同時(shí)間點(diǎn)ET-1的表達(dá)量比較

3 討論

蕨麻小型豬又名合作豬,主要分布在海拔3 000米以上甘肅省甘南藏族自治州,是高原高寒農(nóng)牧區(qū)通過放牧采食進(jìn)行飼養(yǎng)的原始地方小型豬種,具有極強(qiáng)的適應(yīng)高原環(huán)境的特性[13],作為一種具有高原特性的小型豬尤其適合作為高原疾病模型H-MODS的建立[14]。本研究利用LPS誘導(dǎo)蕨麻豬成功建立H-MODS模型,對(duì)蕨麻豬發(fā)生MODS時(shí)的ET-1和eNOS表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè),研究?jī)烧咴贖-MODS發(fā)生發(fā)展中的變化特點(diǎn)及作用。

ET-1和NO是一類具有維持血管舒縮功能的重要活性物質(zhì),在正常情況下機(jī)體內(nèi)ET-1和NO處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài),它們共同維持血管的正常功能和狀態(tài)[15];一旦機(jī)體的ET-1軸及NO系統(tǒng)信號(hào)通路發(fā)生異常,兩者平衡關(guān)系被打破,這將引起血管內(nèi)皮功能紊亂和內(nèi)皮脫落壞死,而內(nèi)皮下層各種成分暴露將造成血管壁完整結(jié)構(gòu)的破壞,所以它們的平衡促進(jìn)多種疾病的發(fā)生、發(fā)展,在血管損傷性疾病中具有非常重要的意義[16]。eNOS是合成NO起主要作用的酶,它在調(diào)節(jié)血管壁結(jié)構(gòu)和功能中具有重要作用,參與心血管疾病的病理生理過程。ET-1是由內(nèi)皮細(xì)胞釋放的由21個(gè)氨基酸組成的肽家族,ET-1為主要亞型,是至今發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的縮血管物質(zhì)。ET-1是器官損傷時(shí)機(jī)體釋放的一個(gè)重要細(xì)胞因子[17]。

炎性反應(yīng)是具有血管系統(tǒng)的活體組織對(duì)內(nèi)源性或外源性刺激所做的防御性反應(yīng)。血管內(nèi)局部缺氧、血小板聚集、代謝物堆積、單核細(xì)胞及巨噬細(xì)胞黏附加上機(jī)體的炎性反應(yīng)可以導(dǎo)致血栓及動(dòng)脈斑塊形成、血壓升高、微循環(huán)障礙、瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移等問題發(fā)生。NO參與多種炎性信號(hào)的傳導(dǎo),可與多種炎性因子相互作用,它既是免疫調(diào)節(jié)和炎性反應(yīng)的調(diào)節(jié)因子,也是重要的效應(yīng)因子[18]。本研究中蕨麻豬經(jīng)LPS誘導(dǎo)發(fā)生多臟器炎性反應(yīng)后,其eNOS及ET-1表達(dá)量均在3 h達(dá)到最大,之后開始降低,到24 h已經(jīng)恢復(fù)正常,由此可以看出在LPS誘導(dǎo)蕨麻豬形成高原MODS時(shí)體內(nèi)迅速出現(xiàn)炎信反應(yīng),伴隨著機(jī)體炎性反應(yīng)迅猛發(fā)生,免疫應(yīng)急反應(yīng)隨后即可啟動(dòng),通過免疫調(diào)節(jié)作用最終炎性反應(yīng)得到抑制而達(dá)到體內(nèi)環(huán)境的平衡穩(wěn)定。兩者變化呈現(xiàn)典型的拋物線形變化趨勢(shì),這種變化趨勢(shì)也使得機(jī)體不會(huì)出現(xiàn)過度抗炎性反應(yīng)及免疫功能抑制,使得機(jī)體在MODS發(fā)生炎性反應(yīng)時(shí)及時(shí)得到調(diào)整最后維持機(jī)體的平衡。

另有研究顯示,在高原MODS發(fā)生發(fā)展過程中,炎性及免疫反應(yīng)貫穿整個(gè)疾病的發(fā)展始末,促炎細(xì)胞因子與抗炎細(xì)胞因子之間伴隨著免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)最終取得平衡以達(dá)到內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定,其TNF-α及IL-1β炎性指標(biāo)變化也呈現(xiàn)迅速的拋物線形變化趨勢(shì)[19]。H-MODS的發(fā)生加入了缺氧的打擊因素,而缺氧會(huì)激活eNOS產(chǎn)生NO從而刺激機(jī)體生成大量的氧自由基,過多釋放氧自由基使細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能受到損傷,引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用并形成過氧化產(chǎn)物,并進(jìn)一步通過聯(lián)級(jí)放大效應(yīng)擴(kuò)大活性氧的作用,最終導(dǎo)致機(jī)體的細(xì)胞代謝和功能產(chǎn)生障礙。LPS致蕨麻豬形成MODS 時(shí)導(dǎo)致eNOS水平的變化,而NO 表達(dá)水平的高低對(duì)機(jī)體組織結(jié)構(gòu)與功能具有重要的影響,NO是炎性介質(zhì)瀑布樣連鎖反應(yīng)的最終介質(zhì)之一,它既參與機(jī)體炎性反應(yīng),又介導(dǎo)以CARS為主要特征的免疫功能低下,增加機(jī)體的感染風(fēng)險(xiǎn),因此eNOS表達(dá)水平與MODS的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[20-21]。有研究[22]發(fā)現(xiàn)LPS致大鼠形成MODS時(shí),eNOS表達(dá)量也顯著增加,這表明NO 水平與MODS病情發(fā)展具有一定的相關(guān)性。此外,NO可通過舒張血管作用造成持續(xù)性低血壓容易形成微循環(huán)淤血,從而引起組織細(xì)胞的缺血、缺氧損傷產(chǎn)出大量自由基,這些損傷共同造成組織細(xì)胞破壞形成MODS。

綜上所述,高原MODS發(fā)生發(fā)展過程中ET-1和eNOS變化息息相關(guān),它們無疑也是高原MODS病程發(fā)展的表征因子,同時(shí)進(jìn)一步認(rèn)識(shí)高原MODS致病特點(diǎn),為高原MODS致病機(jī)制的研究提供理論依據(jù)。