單寧酶在黑曲霉中的高效表達及其酶學性質研究

仝丹心，李 杰，何洪彬 ，張 會,

（1.東北農業大學生命科學學院，黑龍江哈爾濱 150030；2.山東師范大學生命科學學院，山東濟南 250014）

單寧酶（單寧酰基水解酶，EC3.1.1.20）也稱鞣酸酶，可在水相中水解沒食子酸單寧、沒食子酸脂類的酯鍵、縮酚酸酯鍵和縮酚羧鍵，生成葡萄糖、沒食子酸和其他醇類化合物[1?4]。自然界中的單寧酶廣泛存在于動物、植物和微生物體內，尤其是真菌類的曲霉屬、青霉屬和根霉屬[5?7]。單寧酶已被列入食品工業的安全添加劑，并在食品、飼料等領域廣泛應用[8?9]。可降低茶湯中單寧酸含量，解決茶飲料“冷后渾”問題[10]；可降低單寧含量，解決果汁類飲料除澀、抗氧化等問題[11?14]；可降低飼料中單寧酸含量，提高營養物質利用率等[15?17]。

不同來源的單寧酶酶學性質差異較大，多數單寧酶的最適溫度在35～50 ℃范圍內，最適pH 在5.5～7.0 范圍內[18?20]。王喆麗[21]發現野生型黑曲霉中單寧酶的酶活力為0.782 U·mL?1，優化后酶活力增加至2.686 U·mL?1。林健輝等[22]以β-環糊精為碳源優化發酵培養基后的單寧酶酶活力為116.51 U·mL?1。徐璐等[23]在土壤中篩選出產單寧酶的黑曲霉Lys117高活性菌株，并對其發酵條件進行優化，優化后酶活達到233.78 U·mL?1。

黑曲霉是規模化生產重組蛋白的理想系統，被譽為“理想的真核蛋白細胞工廠”，是目前和未來工業蛋白質表達系統研究的熱點[24?25]。目前單寧酶仍存在產量低、生產成本高等問題。本研究以糖化酶黑曲霉工業生產菌為宿主菌，該菌株的糖化酶基因位點為轉錄活躍位點，因此，以內源高表達的糖化酶基因glaA位點為基因整合的靶位點，并使用glaA 六拷貝強啟動子和信號肽來提高單寧酶的表達量，并對其酶學性質進行研究，以期使單寧酶的生產性能達到國內領先水平。……