基于網絡藥理學和分子對接技術探討玫瑰花黃酮治療2型糖尿病的作用機制

王天煜,于慧,邢中夫,康璇,劉紅燕,孫久蘭,趙詩陽,趙盼

(1.山東中醫藥大學,山東 濟南 250355;2.平陰縣特色產業發展中心,山東 平陰 250400)

糖尿病(diabetes mellitus,DM)是一組由胰島素絕對或相對分泌不足,胰腺或(和)胰島素利用障礙所引起的代謝紊亂性疾病。主要分為1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus,T1DM)和2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)[1]。國際糖尿病聯合會(International Diabetes Federation,IDF)數據顯示,截至2021年,中國有1.7億成年人患有糖尿病,占全球患病人數的31.7%,成為全球糖尿病患者最多的國家之一[2],預計到2035年,全球糖尿病患者將達到5.92億[3]。

目前,臨床上治療糖尿病的藥物以西藥為主,如瑞格列奈、伏格列波糖、阿卡波糖等,但此類藥物在長期服用過程中有著明顯的副作用如:腎功能障礙、惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉等[4]。近年來,從天然藥用植物中尋找和開發能有效治療糖尿病的藥物已成為新的研究熱點。

玫瑰為薔薇科薔薇屬,多年灌木生植物,在我國各地均有種植,具有疏肝解郁、養血調經等功效[5]。現代研究表明玫瑰花中含有黃酮、揮發油、有機酸、多糖等多種化合物,其中黃酮類成分是主要活性成分之一,具有抗氧化、抗菌、降血糖、抗毒性、抗抑郁等作用[6]。周達等[7]通過體外小鼠實驗證明了玫瑰花黃酮對四氧嘧啶誘導的糖尿病小鼠具有顯著的降血糖作用。郭玉婷等[8]通過體外α-葡萄糖苷酶活性抑制實驗證明玫瑰花對α-葡萄糖苷酶有較好的抑制作用。但其黃酮類成分降血糖作用機制仍不明確。

網絡藥理學是基于系統生物學的理論,可以從整體考察“藥物-靶點-疾病”之間的復雜網絡關系[9],對生物系統進行網絡分析,選取特定信號節點進行多靶點藥物分子設計的新學科,得到學界的廣泛關注和應用。目前已有研究通過網絡藥理學方法,對玫瑰花與疾病之間的作用機制進行多通路的分析,如嚴寶飛等[10]利用網絡藥理學初步探討了玫瑰花的潛在藥理作用及其機理,但未闡述玫瑰花治療糖尿病的具體機制。因此本研究在此基礎上以玫瑰花黃酮為研究對象,采用網絡藥理學方法探究玫瑰花黃酮多途徑、多層次、多靶點間復雜的相互作用關系,旨在從天然產物中尋找能夠有效治療2型糖尿病的成分,為天然藥物治療2型糖尿病提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 主要活性成分的建立課題組前期對玫瑰花黃酮進行提取純化并進行質譜定性檢測,通過對照品比對以及查閱文獻方式建立了玫瑰花黃酮化合物庫。登錄中藥系統藥理學技術平臺數據庫(TCMSP,http://tcmspw.com/tcmsp.php)[11],設置類別為“Chemical name”,使用化合物英文名稱作為關鍵詞,收集整理活性成分的OB值和DL值,將整理出的化合物作為玫瑰花黃酮活性成分。將在PubChem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中獲得的相應化合物的SMILES name輸入到SwissTargetPrediction(www.swisstargetprediction.ch)[12]網站中,選擇物種為“Homo sapiens”,獲取相應的基因靶點,建立最終的活性成分靶點數據庫。

1.2 疾病靶點的篩選使用Disgenet數據庫(https://www.disgenet.org)和GeneCards數據庫[13](https://www.genecards.org/)以“diabetes mellitus type 2”為關鍵詞篩選與2型糖尿病有關的疾病基因靶點。再將上述獲得的化合物靶點與疾病靶點合并取交集,導入到Venny2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)中,建立疾病—化合物共同靶點數據庫。

1.3 關鍵靶點的PPI網絡構建為進一步了解玫瑰花黃酮成分治療糖尿病靶點的相互作用,將整理得到的交集靶點導入到String(https://cn.string-db.org)中,設置物種種類為“Homo sapiens”構建ppi靶點互作網絡關系圖,將結果以tsv格式導出,導入到Cytoscape 3.9.0中,選擇“Analyze Network”選項進行分析,最終以度(degree)值為依據,選擇度值前十的靶點作為核心靶點。

1.4 交集靶點的GO分析和KEGG通路分析將疾病—化合物交集靶點導入DAVID數據庫(https://david.ncifcrf.gov/)[14]中進行GO生物過程富集分析以及KEGG信號通路分析,登錄“微生信”網站(https://www.bioinformatics.com.cn)選擇“富集氣泡圖”,將GO分析和KEGG分析的結果以圖片形式進行展示。

1.5 活性成分與靶點分子對接首先借助Chem3D軟件對之前篩選出的化合物進行能量最小化處理,在PDB數據庫(https://www1.rcsb.org)搜索α-淀粉酶(α-amylase)的相關蛋白,選擇5mey蛋白,下載其pdb格式保存,去除水分子和配體。再通過SYBYL-X軟件將篩選出的玫瑰花黃酮化合物進行分子對接,得到相應的打分結果,最后運用Pymol 2.5.0將能量最低形態的化合物與蛋白對接結果進行可視化處理,以圖片的形式導出并進行展示。

2 結果與分析

2.1 活性成分和作用預測靶點收集課題組根據對照品比對及文獻查詢,得到玫瑰花黃酮提取物成分解析,選擇槲皮素、芹菜素、金絲桃苷、落新婦苷、山柰酚-3-O-葡萄糖苷、橙皮苷、木犀草素、山柰酚、柚皮素、雞豆黃素A和櫻黃素作為主要活性成分進行網絡藥理研究,并在TCMSP網站中收集它們的OB和DL值。分別將以上11種活性化合物名稱輸入到PubChem數據庫中取得相應的SMILES name,再將SMILES name輸入SwissTargetPrediction網站中,以“Homo sapiens”為調查的物種,獲得各個化合物所對應的靶基因,建立化合物靶點庫。

2.2 疾病和化合物靶點的篩選篩選出的11種活性化合物在SwissTargetPrediction網站中共獲得772個靶點,去除重復項后得到246個靶點。在DisGeNET數據庫和GeneCards數據庫中以“diabetes mellitus type 2”為關鍵詞,以打分值大于43為標準,去重后共檢索出與2型糖尿病相關的基因靶點7 548個,使用Venny2.1.0對疾病靶點與活性成分靶點進行維恩圖繪制,得到共同靶點207個,見圖1,其中靶點包括NOX4、AVPR2、MMP13、PIK3R1等。

圖1 玫瑰花活性成分靶點與糖尿病交集靶點

表1 玫瑰花黃酮活性成分及其參數

2.3 “藥物成分—作用基因”網絡圖構建將“2.2”項下收集到的化合物成分與其對應的靶點基因信息錄入到Cytoscape 3.9.0中生成“藥物成分—作用基因”網絡圖,結果如圖2所示。圖中共有218個節點,667條邊,節點之間的連線表明兩者之間存在相互作用關系,連線越密集則兩者關聯度越高。其中,各化合物與編號之間的對應關系及各自匹配到的靶標數如表2所示。通過靶標數作為評價標準,可以分析得到槲皮素、芹菜素、橙皮苷、木犀草素、山柰酚、柚皮素的靶標數均較多,推測這些化合物可能在糖尿病的治療或輔助治療中發揮重要作用。

圖2 玫瑰花“藥物成分—作用基因”網絡圖

表2 化合物編號及靶標數

2.4 玫瑰花治療糖尿病的作用靶點拓撲分析使用String數據庫構建ppi靶點網絡互作圖,將“2.2”項下得到的疾病和化合物交集靶點導入String中,得到蛋白互作網絡圖(如圖3所示),其中number of nodes=207、number of edges=2 144、average node degree=20.7、avg.local clustering coefficient=0.527、expected number of edges=851。將所得結果以TSV格式導出,使用Cytoscape 3.9.0軟件進行拓撲分析,以“Analyze Network”選項中共有靶點的自由度、介數和中心性作為參考標準,結果發現AKT1(degree=111)、TNF(degree=100)、VEGFA(degree=92)等綜合排名較高,具體情況如表3所示,表明這些靶點是玫瑰花黃酮成分治療糖尿病的關鍵靶點。

圖3 ppi蛋白網絡互作圖

表3 ppi核心靶點篩選結果

2.5 GO生物學功能富集分析為進一步探究玫瑰花黃酮治療糖尿病的多重作用機制,將207個共同靶點導入DAVID中進行GO富集分析,共得到富集結果208條。選擇前20條富集結果的生物過程(bp)、分子功能(mf)和細胞組成(cc)以氣泡圖的形式展示,如圖4所示。其中,生物過程(BP)方面主要與蛋白質磷酸化、MAP激活酶與絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)的調控、蛋白酶信號傳導的調節和細胞凋亡通路有關;分子功能(MF)方面主要與蛋白質絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性的調節、酶結合與ATP結合、相同蛋白結合和蛋白磷酸酶結合等過程有關;細胞組成(CC)方面則主要涉及質膜的組成、細胞外泌體、細胞質和胞外區等。

圖4 GO功能富集分析圖

2.6 KEGG通路分析

將207個共同靶點導入DAVID數據庫進行KEGG通路分析,物種選擇“Homo sapiens”,共得到分析結果186條。將富集結果較顯著的前20條結果以富集氣泡圖的形式進行展示,如圖5所示,圖中圓圈的大小表示相關靶點在該通路富集的多少,越大代表通路越多;圓圈的深淺代表富集的程度,顏色越淺程度越高。其中癌癥通路、脂質與動脈粥樣硬化、糖尿病AGE-RAGE信號通路和PI3K-Akt信號通路富集程度較高,推測玫瑰花黃酮化合物主要是通過與這幾條通路相互作用發揮治療2型糖尿病的作用。

圖5 KEGG富集結果氣泡圖

2.7 分子對接結果網絡藥理結果已經得出部分關鍵靶點玫瑰花治療糖尿病方面所發揮的積極作用,于是為了進一步探究玫瑰花對人體內糖類分解酶的作用效果,選擇α-淀粉酶的結晶復合物蛋白5mey與玫瑰花中活性成分進行分子對接。將對接結果以總打分值(Total Score)作為評價標準,選擇打分排名前十的化合物為對接結果較好的化學成分,Total Score越高說明化合物分子與蛋白結合越穩定。篩選出的有效活性成分結果如表4所示。其中橙皮苷、落新婦苷、槲皮素等均與蛋白結合穩定,推測將會有不錯的作用效果。將化合物與蛋白進行可視化展示,部分展示結果如圖6所示。

圖6 分子對接可視化結果

表4 活性成分與靶標蛋白分子對接得分

3 討論

中藥作為我國傳統中醫藥理論體系指導下使用的天然藥物,經過千百年來的人用經驗已經證實其在糖尿病及其并發癥的治療方面有著良好的療效和廣闊的發展前景。而網絡藥理作為近年來新興的分析學科,與玫瑰花這一傳統中藥相結合,能夠從靶點通路角度為玫瑰花治療糖尿病的機制提供新的研究思路[15]。因此本實驗用網絡藥理學和分子對接技術探究玫瑰花治療2型糖尿病的作用機理。

結果方面,槲皮素、山柰酚、木犀草素、橙皮苷和芹菜素在PPI網絡構建中靶標數較多,說明這幾種化合物是玫瑰花黃酮成分中對糖尿病起治療作用的關鍵活性成分。其中,有相關研究證明槲皮素、山柰酚和木犀草素與AKT1、TNF、EGFR和VEGFA等靶點相關性較高,并且能通過癌癥通路、AGE-RAGE通路和PI3K-AK通路等關鍵信號通路發揮治療糖尿病的作用[16-18],是治療糖尿病方面關鍵的活性成分。劉春穎等[19-20]通過實驗證明了芹菜素可以通過競爭性抑制小鼠腸道中α-葡萄糖苷酶、蔗糖酶和麥芽糖酶的活性來發揮降血糖的藥理作用。橙皮苷則是通過抑制細胞凋亡傳導的途徑、調控TNF相關靶點對糖尿病有一定的預防保護和改善作用[21]。

4 結論

綜上所述,玫瑰花主要通過含有的槲皮素、木犀草素和山柰酚等黃酮成分來調控人體內AGE-RAGE、PI3K-Akt等信號通路,從而發揮治療2型糖尿病的作用。研究結果為玫瑰花用于治療2型糖尿病的作用機制提供了理論依據。