UHPLC-MS/MS法測定鹽酸普萘洛爾緩釋片中基因毒性雜質(zhì)N-亞硝基普萘洛爾

黃海偉,袁松,張娜,張龍浩,劉陽,張慶生

(中國食品藥品檢定研究院,國家藥品監(jiān)督管理局化學藥品質(zhì)量研究與評價重點實驗室,北京 102629)

鹽酸普萘洛爾化學名稱為1-異丙基-3-(1-萘氧基)-2-丙醇鹽酸鹽(見圖1A),鹽酸普萘洛爾為非選擇性競爭抑制β受體阻滯劑[1],臨床上常用于高血壓、心律失常和心絞痛的治療[2-3]。2022年3月加拿大衛(wèi)生部(Health Canada)發(fā)布通告,輝瑞制藥公司自愿召回60、80、120、160 mg 4種規(guī)格共29批次鹽酸普萘洛爾緩釋膠囊,此次召回是因為在這些批次中檢測出超過每天允許攝入量的N-亞硝基普萘洛爾(見圖1B)[4-5]。

圖1 鹽酸普萘洛爾(A)及N-亞硝酸普萘洛爾(B)的結構式

N-亞硝基類化合物具有直接或間接的致癌作用,長期小劑量接觸或單次較大劑量接觸都可能致癌[6-8],亞硝胺類化合物是由于藥物生產(chǎn)過程中發(fā)生了某些副反應而產(chǎn)生。自2018年纈沙坦中N-二甲基亞硝胺(NDMA)檢出以來,又有N-二乙基亞硝胺(NDEA)、N-亞硝基-N-甲基-4-氨基丁酸(NMBA)等雜質(zhì)陸續(xù)在藥品中檢出,國家藥品監(jiān)督管理局、美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)以及歐洲藥品管理局(EMA)都發(fā)布了有關藥品中遺傳毒性雜質(zhì)控制策略、檢測方法以及限度要求等指導原則,多個藥品因N-亞硝基類化合物超出每日允許攝入量被召回[9-11]。已報道的N-亞硝基類化合物主要分為兩類,一類與藥物本身結構無關,在藥品生產(chǎn)過程中由殘留溶劑等引入,例如NDMA、NDEA等;一類則直接與藥物本身相關,通常是原料藥中的仲胺結構與微量殘留的亞硝酸鹽反應生成相應的雜質(zhì)[12-14]。N-亞硝基普萘洛爾屬于上述的第二類雜質(zhì),只在普萘洛爾相關制劑中被發(fā)現(xiàn)。目前尚無該基因毒性雜質(zhì)檢測及限度的相關報道,本文擬采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UHPLC-MS/MS)建立鹽酸普萘洛爾緩釋片中N-亞硝基普萘洛爾的檢測方法,為鹽酸普萘洛爾中遺傳毒性雜質(zhì)檢查和質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器Agilent 1290-6470液相色譜-串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜儀(美國Agilent公司),配備電噴霧離子源(ESI)和Masshunter數(shù)據(jù)處理系統(tǒng);XP205DR型電子分析天平(瑞士Mettler公司),Milli-Q超純水純化系統(tǒng)(美國Millipore公司)。

1.2 藥物與試劑甲醇(質(zhì)譜級,美國Fisher Scientific公司),乙腈(質(zhì)譜級,美國Sigma-Aldrich公司),甲酸(質(zhì)譜級,德國Merck公司),甲酸銨(質(zhì)譜級,美國Fisher Scientific公司),水為超純水,N-亞硝基普萘洛爾對照品(批號:PN20220312,PERIDA公司,純度96.8%),鹽酸普萘洛爾緩釋片(市場采購)。

2 方法與結果

2.1 溶液制備

2.1.1 標準曲線對照品溶液制備精密稱取N-亞硝基普萘洛爾對照品10.43 mg,置100 mL量瓶中,加甲醇使溶解并稀釋至刻度,搖勻,作為對照品儲備液。精密量取對照品儲備液0.1 mL,置100 mL量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,搖勻,精密量取1.0、2.0、5.0、7.0、10.0、10.0 mL上述溶液分別置100、100、100、100、100、50 mL量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,搖勻,作為濃度分別約為1.0、2.0、5.0、7.0、10.0、20.0 ng·mL-1的系列線性溶液。

2.1.2 供試品溶液制備取本品10片,精密稱定,研細,混勻,精密稱取約相當于鹽酸普萘洛爾20 mg的細粉,置15 mL離心管中,精密加入甲醇5 mL,渦旋3 min,濾過,取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2 色譜及質(zhì)譜條件

2.2.1 色譜條件采用Waters ACQUITY UPLC CSHTMC18(150 mm×3.0 mm,1.7 μm)色譜柱;以10 mmol·L-1甲酸銨的水溶液(含0.1%甲酸)作為流動相A,乙腈溶液(含0.1%甲酸)作為流動相B,梯度洗脫:0.0～5.0 min, 50%B;5.0～7.0 min, 50%B→70%B;7.0～9.0 min, 70%B;9.0～9.0 min, 70%B→50%B;9.0～13.0 min, 50%B;流速為0.5 mL·min-1,柱溫為50 ℃,進樣器溫度為5 ℃,進樣體積為10 μL。

2.2.2 質(zhì)譜條件采用電噴霧離子源(electrospray Ionization Source,ESI),正離子檢測模式,干燥氣溫度為300 ℃,干燥氣流量為6 L·min-1,噴霧電壓為35 psi,鞘氣溫度為350 ℃,鞘氣流量為10 L·min-1,毛細管電壓為4 500 V。采集方式為多反應監(jiān)測(Multiple reaction monitor,MRM)模式,以m/z289.2→72.2作為定量離子對,碎裂電壓為78 V,碰撞電壓為12 V,以m/z289.2→145.1作為定性離子對,碎裂電壓為78 V,碰撞電壓為12 V。

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性試驗取甲醇作為空白溶劑和“2.1.1”項下1 ng·mL-1的對照品溶液,分別進樣,記錄色譜圖(見圖2),在所建立的色譜和質(zhì)譜條件下,N-亞硝基普萘洛爾的保留時間為6.74 min,峰型良好,空白溶劑對檢測無干擾。

A.甲醇溶液;B.對照品溶液

2.3.2 檢測限與定量限試驗取“2.1.1”項下1 ng·mL-1的線性溶液,以甲醇為稀釋劑逐步稀釋,分別在信噪比(S/N)為10∶1和3∶1時作為定量限和檢測限,測得N-亞硝基普萘洛爾的定量限和檢測限分別為0.3、0.09 ng·mL-1。

2.3.3 線性關系考察精密量取“2.1.1”項下系列線性溶液,進樣檢測,記錄色譜圖。以N-亞硝基普萘洛爾峰面積Y為縱坐標,以質(zhì)量濃度X(ng·mL-1)為橫坐標進行線性回歸,得N-亞硝基普萘洛爾的線性回歸方程為Y=2 563.38X-161.38(r=0.999 9),結果表明在1.01～20.19 ng·mL-1濃度范圍內(nèi),N-亞硝基普萘洛爾峰面積與質(zhì)量濃度之間呈良好的線性關系。

2.3.4 精密度和重復性試驗取“2.1.1”項下5.0 ng·mL-1的線性溶液連續(xù)進樣6次,得N-亞硝基普萘洛爾峰面積的RSD為1.13%,結果表明系統(tǒng)精密度良好。取鹽酸普萘洛爾緩釋片,按“2.1.2”項下方法平行制備6份供試品溶液,進樣檢測,按標準曲線法計算N-亞硝基普萘洛爾含量,計算得6份供試品溶液中N-亞硝基普萘洛爾含量的RSD為3.58%。結果表明方法具有良好的重復性。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗取“2.1.1”項下5.0 ng·mL-1的線性溶液,放置于進樣盤,分別在0、8 h進樣檢測,結果N-亞硝基普萘洛爾峰面積的相對偏差為2.96%,結果表明5 ℃條件下對照品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定;取“2.3.4”項下1份重復性試驗供試溶液,放置于進樣盤,分別在0、2、5、7 h進樣檢測。結果N-亞硝基普萘洛爾峰面積的RSD(n=4)為2.66%,結果表明5 ℃條件下供試品溶液在7 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.6 提取效率試驗取鹽酸普萘洛爾緩釋片,按“2.1.2”項下方法平行制備2份供試品溶液,其中1份渦旋3 min,另一份渦旋10 min,進樣檢測,按標準曲線法計算N-亞硝基普萘洛爾含量,計算得2份供試品溶液中N-亞硝基普萘洛爾含量相對標對偏差為3.77%。結果表明渦旋3 min可提取完全。

2.3.7 回收率試驗取鹽酸普萘洛爾緩釋片,精密稱定,研細,混勻,精密稱取細粉約57 mg(約相當于鹽酸普萘洛爾20 mg),置15 mL離心管中,精密加入“2.1.1”項下10 ng·mL-1(高濃度)、5 ng·mL-1(中濃度)、2 ng·mL-1(低濃度)的線性溶液5 mL,渦旋3 min,濾過,取續(xù)濾液作為回收率溶液,每個濃度點平行制備3份,進樣檢測,結果見表1,低、中、高濃度點的回收率分別為98.4%(RSD2.7%,n=3)、101.6%(RSD1.1%,n=3)、103.2%(RSD1.5%,n=3),結果表明回收率良好。

表1 加樣回收率結果

2.4 樣品測定按“2.1”項下制備鹽酸普萘洛爾緩釋片供試品溶液,照“2.2”項下條件進樣檢測,記錄色譜圖,以峰面積按標準曲線法計算供試品溶液中N-亞硝基普萘洛爾的含量,測得鹽酸普萘洛爾緩釋片中N-亞硝基普萘洛爾含量為1.8 μg·g-1。

3 討論

由于鹽酸普萘洛爾供試品溶液濃度較高,普萘洛爾峰與N-亞硝基普萘洛爾峰需要達到較大的分離度,才能將普萘洛爾峰切入廢液不至于干擾雜質(zhì)的檢測,所以首先對不同類型的色譜柱進行了考察,最終選用Waters ACQUITY UPLC CSHTMC18色譜柱,N-亞硝基普萘洛爾峰型良好,且可與普萘洛爾峰完全分離,但兩者洗脫時間較長,為提高實驗效率在此基礎上對色譜條件進行優(yōu)化,增加有機相比例以縮短分析時間;不同流動相系統(tǒng)對色譜保留和雜質(zhì)的質(zhì)譜響應影響非常大,對流動相系統(tǒng)進行了考察,當采用乙腈為流動相時體系,N-亞硝基普萘洛爾出峰較快,且質(zhì)譜響應增強,可滿足分析的分離度要求。前期的試驗顯示N-亞硝基普萘洛爾在甲醇中易溶,在乙腈中微溶,以甲醇-水作為溶劑為較優(yōu)選擇,但緩釋片加極少量水后即成凝膠狀無法進樣檢測,為保證提取完全和樣品檢測的準確性,選擇了以甲醇作為溶劑,以甲醇作為溶劑時,存在一定的溶劑效應,N-亞硝基普萘洛爾峰前沿,峰形變寬,靈敏度降低,為此,采用較大內(nèi)徑的色譜柱,并增加進樣體積至10 μL,即可滿足N-亞硝基普萘洛爾檢測靈敏度的要求。

目前未見N-亞硝基普萘洛爾的毒理學數(shù)據(jù),暫無明確控制限度,提示藥品研發(fā)生產(chǎn)、相關科研機構應對雜質(zhì)進行深入的毒理研究以建立合理的控制限度,保障用藥安全。

4 結論

本研究建立了鹽酸普萘洛爾緩釋片中N-亞硝基普萘洛爾的UHPLC-MS/MS檢測方法,并進行了相關方法學驗證,結果表明,所建立的方法具有良好的專屬性、靈敏度和準確度,可準確測定鹽酸普萘洛爾緩釋片中潛在的N-亞硝基普萘洛爾的含量,有助于鹽酸普萘洛爾緩釋片的市場監(jiān)管,保障藥品質(zhì)量安全。