急性髓系白血病中組蛋白乙酰化研究進展

范世潔，王曼曼，黃贊*

（1.武漢大學 生命科學學院，湖北武漢 430072；2.安徽中醫藥大學 新安醫學教育部重點實驗室，安徽合肥 230031）

急性髓系白血病（Acute Myeloid Leukemia，AML）是一類起源于造血干/祖細胞惡性擴增的血液腫瘤，表現為克隆性增殖的異常分化或低分化造血細胞在骨髓、血液和其他組織中的廣泛浸潤。隨著人們對AML 認識的不斷深入，AML 治療在近20 年來有了長足的進步，總體治愈率在30%～40%，部分類型白血病如急性早幼粒白血病的5 年生存率甚至可以達到90%[1-2]。然而，AML 在細胞遺傳學上有顯著異質性，并且存在多種不良預后類型的AML，其臨床治療效果依然不容樂觀。

驅動AML 發生的遺傳變異涵蓋了點突變、缺失、擴增、基因易位等。腫瘤基因組圖譜研究顯示這些遺傳變異在功能上主要分為9 類[3]，其中DNA 甲基化和表觀遺傳修飾因子是AML 重現突變驅動基因中的一大類，是影響白血病起始、發生和發展的關鍵因素之一。多種DNA 甲基化/去甲基化酶以及識別蛋白在造血和白血病發生中的生理病理功能已有廣泛研究，相應抑制劑也在白血病臨床治療中得到應用[4]。組蛋白修飾是表觀遺傳的另一個重要內容，主要包括甲基化、乙酰化、磷酸化等，參與調控染色質結構和基因表達，在多種生物學過程中發揮重要作用[5]。相對其他表觀遺傳修飾，組蛋白乙酰化在白血病發生、發展和治療中的作用及意義并未得到充分認識，靶向組蛋白乙酰化治療AML 的策略依然面臨諸多挑戰。

1 組蛋白乙酰化

組蛋白乙酰化修飾發生在組蛋白N 端尾部的多個賴氨酸殘基上，影響染色質構象，導致轉錄復合物的募集改變，并最終調節基因表達。作為DNA 包裝的支柱，組蛋白在基因表達調控中起著核心作用，并有助于正常細胞功能的發揮；異常組蛋白表觀遺傳共價修飾可能是控制細胞中功能失調相關基因表達的因素，尤其在癌細胞中。組蛋白H3 的N 端賴氨酸乙酰化修飾與轉錄激活密切相關，是一個高度調節和可逆的過程，由特定的蛋白質家族介導。組蛋白乙酰化的動態平衡及細胞生物學功能主要依賴由乙酰輔酶A 輔助的乙酰轉移酶（HAT）作為組蛋乙酰化“編寫器”來乙酰化組蛋白，由NAD+或鋅輔助因子輔助的脫乙酰基酶（HDAC）作為“橡皮擦”來移除組蛋白的乙酰化修飾，以及HAT 及相關蛋白（如GCN5L2）、組蛋白甲基轉移酶（例如ASH1L 和MLL）、溴域蛋白（BET）蛋白家族、轉錄共激活因子、核支架蛋白PBRM1 等作為表觀遺傳“閱讀器”來識別賴氨酸上的乙酰基[6]。

本系統的開發軟件為Delphi 7.0；數據庫管理系統為oracle 9i；輔助處理系統為office2003Photoshop 6.0。計算機操作系統選用：Windows9x2000NTXP或更高級的操作系統都可以安全運行本系統。

2 組蛋白乙酰化調控失衡參與AML 發生

異常的組蛋白乙酰化修飾被證明與AML 密切相關，且AML 病人往往呈現低水平組蛋白乙酰化[7-8]。組蛋白乙酰化“編寫器”“閱讀器”等介導的乙酰化調控失衡是AML 發生、發展中不可忽視的因素。

2.1 組蛋白乙酰化“編寫器”參與AML 發生

HAT 家族的多個成員的遺傳變異導致HAT 活性失調是白血病發生的驅動突變，其中融合HAT 基因的染色體重排是導致AML 組蛋白乙酰化調控異常最直接的因素。這些AML 亞類攜帶t（11;16）（q23;p13.3）、t（8;16）（p11;p13）和t（8;22）（p11;q13）的 嵌合轉錄本，分別編碼MLL-CREBBP、MOZ-CREBBP和MOZ-EP300 融合蛋白，引起AML 的驅動遺傳變異[9]。HAT 與髓系惡變的相關性并不局限在融合伴侶，MLL-AF9 和NUP98-HOXA9 驅動的白血病增殖依賴MOF 乙酰轉移酶活性，無乙酰輔酶A 結合能力的MOF 突變體會顯著影響融合蛋白轉化骨髓細胞的克隆形成效率[10]；NUP98-HOXA9 和CBFB-MYH11招募乙酰化轉移酶引起特異位點組蛋白乙酰化修飾水平升高是白血病發生的重要機制[11-12]。混合譜系白血病（Mixed Lineage Leukemia，MLL）中DOT1L 靶基因的H3K79me2 修飾能夠促進組蛋白乙酰化修飾，并在MLL 白血病中發揮重要作用[13]。組蛋白乙酰化轉移酶HBO1 在維持白血病干細胞中發揮關鍵作用，HBO1 缺失能延長MLL-AF9 小鼠白血病模型的存活時間[14]。NUP98-HBO1 融合蛋白則是造成慢性粒細胞白血病的因素[15]。HAT 在AML 中的相關性還超越乙酰轉移酶活性。例如，香豆素（Celastrol）通過破壞Myb 類轉錄因子家族和EP300 融合蛋白之間蛋白質相互作用抑制Myb 激活的靶基因，這種抑制作用與EP300 乙酰轉移酶活性抑制不相關；同時抑制EP300酶活性及其與Myb 的相互作用也可以協同誘導體外模型中的白血病細胞髓系分化[16]。這些研究表明HAT 同時具備酶活和支架功能，顯示異常組蛋白乙酰化在白血病發生發展中的關鍵作用。

長葉山蘭發現于貴州雷公山，生境海拔1 988 m，生于路邊林下潮濕溝谷，伴生種有竹根七、樓梯草、水芹、黔川烏頭等。2015年9月20日引種保存于貴陽藥用植物園，2018年5月首次開花后進行了鑒定，憑證標本：HXQ2015092034HT。

按：“薦祀”，猶祭祀。“薦祀”，其他文獻用例亦富，例如《風俗通義》卷第五：“還歷鄉里，薦祀祖考。”《樊川文集》卷第六《三子言性辯》：“梁武帝起為梁國者，以筍脯麥牲為薦祀之禮。”《震川先生集》卷三十《告昆山縣城隍神文》：“奕奕新廟，薦祀馨香。”《牧齋初學集》卷第五十三《明故陜西革昌府通判錢君墓志銘》：“漢有良吏，樂府流傳。弦歌薦祀，安陽亭西。”《樂府詩集》卷第八《豫章府君登歌》：“嘉樂在庭，薦祀在堂。”“薦祀”一詞，《漢語大詞典》未收。

Lys-CoA 和H3-CoA-20 是最早的雙底物類似物，選擇性抑制p300 和PCAF。無心果酸（anacardic acid）、藤黃酚（garcinol）和姜黃素（curcumin）是有效的天然p300 和PCAF 抑制劑。其他化合物如藤黃酚類似物、γ-丁內酯MB-3、異噻唑酮（isothiazolones）和喹啉（quinoline）衍生物可抑制特定的HAT 成員并有效阻斷某些實體腫瘤細胞系的增殖，但其作用機理仍未闡明[55]。噻唑的衍生物CPTH6 能抑制GCN5 和PCAF 活性，降低AML 細胞整體的乙酰化水平，誘導細胞凋亡和分化[56]。MOZ 和MORF 雙價抑制劑能與乙酰輔酶A 強力競爭，在小鼠模型中抑制白血病細胞增殖[57]。HAT 選擇性抑制劑C646（吡唑啉酮-呋喃化合物）特異靶向CREBBP 的催化活性及相關乙酰轉移酶EP300（也稱為KAT3B），能顯著降低組蛋白乙酰化水平，在10 個測試的AML 組織培養細胞系中顯著降低了8 個細胞系的增殖，并在多個亞型的AML 中展現出良好的臨床前治療效果[58]。乙酰賴氨酸競爭性抑制劑特異性抑制CBP/p300 的BRD 結構域，顯著降低AML 細胞增殖，破壞MLL-AF9 驅動的白血病起始細胞的自我更新和疾病進展[59]。雙氟尼醛（diflunisal）與乙酰輔酶A 競爭CBP/p300 活性催化位點，有效阻止組蛋白乙酰化，抑制依賴p300 的AML-ETO 白血病細胞增殖[60]。然而，HAT 抑制劑的選擇性和生物利用度低，使得這些抑制劑難以進入臨床實驗。

針對于我國會計師事務所的實際發展情況，事務所業務多層次發展必將成為一種大趨勢，所以，現階段的事務所應當分析多方面要素的影響，適時更新經營理念、與時俱進，發揮國家政策、服務質量等因素對事務所的貢獻，提高自身核心競爭力。與此同時，把握住主觀因素對事務所自身的影響，探尋出適合自身情況的多層次發展對策，進而使會計師事務所實現更健康、更良性的發展、同時亦為我國注冊會計師行業的可持續發展做出長足貢獻。

2.2 AML 與識別組蛋白乙酰化賴氨酸的表觀遺傳“閱讀器”相關

干擾組蛋白乙酰化“閱讀器”的功能是另外一種針對組蛋白乙酰化的干預方式。多種BET 蛋白抑制劑能模擬乙酰化賴氨酸阻止BET 識別組蛋白乙酰化賴氨酸，其功能已經在包括白血病在內的幾種腫瘤類型中進行了測試，見表2。

其中，小分子JQ1（硫代三唑并二嗪）和I-BET151（3,5-二甲基異惡唑衍生物）在體外和體內均可有效誘導MLL 重排白血病細胞的細胞周期阻滯和凋亡[65,80]。這些抑制劑的作用是將BRD4 從調節元件中置換出來，并在特定癌基因（包括c-MYC、BCL2 和CDK6）的位點上阻斷RNA Pol II 介導的轉錄延伸。同樣，BET 抑制劑OTX015（JQ1 衍生物）顯示出在多種白血病細胞類型中誘導凋亡的能力[81]。目前多項BET 抑制劑已經開展臨床試驗（表3）。

寒假的第二天，天氣清朗。冬日的陽光白白的，好像力度不夠，曬在人身上，也還覺得暖洋洋的。陳浩的家和我家在同一條街上，吃完早飯，我就出發去他家了。

3 靶向組蛋白乙酰化治療AML 的策略

基于對組蛋白乙酰化在白血病發生中的功能認識，干預組蛋白乙酰化是潛在白血病治療策略。通常干擾組蛋白乙酰化的策略有3 種：破壞組蛋白乙酰化“閱讀器”BET 與HAT 蛋白復合物締合的復合物抑制，抑制HAT 乙酰基轉移酶活性或HDAC 去乙酰化酶活性的抑制劑，以及阻止BET 蛋白與乙酰化的組蛋白結合的變構位點抑制。

3.1 靶向組蛋白乙酰化的HAT 抑制劑

到目前為止，經調查，僅有少數組蛋白乙酰轉移酶抑制劑（HAT 抑制劑）被鑒定出來（表1），其在白血病治療中尚未得到廣泛研究。

DPF2（Double Plant Homeodomain Finger 2）是高度進化保守的d4 蛋白家族成員，含有植物同源結構域（PHD 手指結構域），能結合組蛋白的乙酰化賴氨酸組。有研究顯示DPF2 能抑制造血干/祖細胞髓系分化，抑制AML 細胞增殖，而組蛋白結合缺陷的DPF2 突變體則喪失抑制髓系分化的能力[25-26]。這些研究表明DPF2 可能在白血病發生中發揮重要作用。

表1 HAT 抑制劑的臨床前研究進展

一項細胞系蛋白質譜研究表明H3K9 甲基化，H3K14、H3K18 和H3K23 乙酰化水平以及潛在的H4K20 甲基化水平升高與白血病細胞阿霉素耐藥性有關，涉及轉錄激活和沉默[17]。同時，非APL 類型的AML 細胞對ATRA 等誘導分化劑誘導分化治療具有抗性，這種抗性與組蛋白乙酰化轉移酶GCN5 和PCAF 相關：GCN5 通過調控H3K9 乙酰化控制干性和白血病相關基因表達，阻止ATRA 誘導白血病細胞髓系分化[18]。同時，PCAF 能誘導ATRA 靶基因啟動子區域的H3 組蛋白乙酰化，是全反式維甲酸誘導AML 細胞向粒細胞終末分化所必需的[19]。

3.2 靶向組蛋白乙酰化的HDAC 抑制劑

相較于HAT 抑制劑，組蛋白去乙酰化酶抑制劑（HDAC 抑制劑）則顯示出良好的治療功效。目前，美國FDA 已經批準了多種HDAC 抑制劑用于治療多種白血病，如伏立諾他（Vorinostat）、帕比司他（Panobinostat）和貝利司他（Belinostat）等。多項研究評估了HDAC 抑制劑在AML 中的療效，并取得了可喜的結果。在t（8;21）驅動的AML 的體內模型中，給藥Panobinostat 觸發病原性AML1/ETO 融合蛋白的蛋白酶體降解，從而導致了終末髓樣分化，并在小鼠中獲得了出色的存活率[61]。然而，Panobinostat 的活性僅限于AML/ETO 的這一AML 亞類，無法推廣到更多AML 類型中。這些結果表明無論是HAT 還是HDAC 的抑制劑都有抑制AML 的效果，提示AML 細胞中的HAT 和HDAC 活性平衡可能是決定AML 發生和惡變的重要因素，總的組蛋白乙酰化水平則影響較小；采用何種方法干預AML 細胞中組蛋白乙酰化穩態以及AML 對相應干預方法的敏感性可能取決于AML 起源的特定遺傳變異背景。

3.3 靶向表觀遺傳的BET 抑制劑

這些表觀遺傳“閱讀器”具有專門的結構域識別核小體乙酰化修飾，充當其他調控因子的募集支架。BET 蛋白是一類乙酰結合蛋白，它們通過在賴氨酸殘基處結合組蛋白和非組蛋白的乙酰基團發揮作用。其中，BRD4 是發育和細胞分化中轉錄網絡的關鍵調節因子，也是驅動腫瘤細胞異常轉錄程序的關鍵參與者；BRD4 結合并識別稱為“超級增強子”的H3K27乙酰化的特殊區域，控制多個譜系特異性基因表達，并可能被腫瘤細胞劫持以表達關鍵的癌基因[20]。在AML 細胞中，BRD4 維持c-MYC 的表達以促進白血病細胞自我更新[21]。除了組蛋白乙酰化染色質“閱讀器”活性以外，研究還顯示BRD4 具有HAT 活性，可導致染色質松弛并在物種間保持保守[22]。

表2 BET 蛋白抑制劑的臨床前研究

含 有YEATS 結 構 域 的ENL（Eleven-Nineteen Leukemia）和AF9 是另一類組蛋白乙酰化“閱讀器”[23]。YEATS 域傾向識別部分乙酰化組蛋白肽，包括H3K27ac、H3K9 和H3K18 乙酰化。t（11;19）（q23;p13.1）染色體易位導致ENL 與MLL（KMT2A）基因融合，（9;11）(q22;q23)染色體易位導致AF9 與MLL 基因融合，隨之表達的MLL-ENL 和MLL-AF9嵌合蛋白是白血病的驅動遺傳變異，導致基因表達失調，促進急性白血病的發生。ENL 耗竭具有抗白血病效應，包括增加終末髓樣分化和抑制體外和體內白血病細胞增殖。ENL 與乙酰化組蛋白H3 結合，并與H3K27 和H3K9 乙酰化共同定位在對白血病至關重要的活躍轉錄基因的啟動子上[24]。

表3 BET 蛋白抑制劑的臨床研究進展

小分子RO6870810/TEN-010（JQ1 類似物）已在難治性AML 和骨髓增生異常綜合征（Myelodysplastic Syndromes，MDS）進行了Ⅰ期試驗（NCT02308761），BET 抑制劑CPI-0610（氯苯甲基乙二唑苯扎西汀）的Ⅱ期試驗測試了其與蘆可替尼（ruxolitinib）聯用治療骨髓纖維化（NCT02158858）的效果。在同一管線上，BRD4 抑制劑GSK525762 進入了難治性血液惡性腫瘤復發患者的早期臨床試驗。BET 抑制劑BI-894999（屬于三唑吡嗪類）與其他BET 抑制劑在結構上截然不同，雖然調控與JQ1 相同的基因，但在殺死原代AML 細胞和異種移植模型的AML 細胞方面更出色，與CDK9（轉錄延伸復合物的組成部分）抑制劑的組合可大大增強其抗腫瘤作用[91]。雖然靶向BET 蛋白在白血病治療方面取得相當好的進展，但仍然缺乏有價值的BET 轉基因動物模型來闡明BET 抑制劑的毒性作用及其發揮作用的機理。

4 ANP32A 調控AML 組蛋白乙酰化

ANP32A 屬于ANP32（Acid Nuclear Phosphoprotein，32 kDa）基因家族成員，是組蛋白乙酰轉移酶抑制復合物的組分，能與非修飾的組蛋白N 末端結合，體外抑制組蛋白H3 乙酰化修飾。除了結合組蛋白抑制乙酰化以外，早期研究顯示ANP32A 還具有多種功能，包括抑制去磷酸化酶PP2A、激活凋亡小體、mRNA轉運、結合微管相關蛋白（Microtubule-Associated Protein，MAP）等[92]。最近的研究表明ANP32A 調控ATM（Ataxia Telangiectasia-Mutated）表達阻斷軟骨、腦和骨的氧化應激，而ANP32A 的種屬差異是決定甲型流感病毒聚合酶宿主局限性的原因[93-94]。

研究表明，ANP32A 是白血病發生的重要調控因子，是影響AML 細胞組蛋白乙酰化的重要因素。ANP32A 耗竭能顯著抑制AML 病人原代細胞和AML細胞系的增殖與克隆形成能力，ANP32A 缺失會損害MLL-AF9 體外轉化小鼠骨髓細胞的能力[95-96]。深入的機制研究顯示，盡管ANP32A 不具備HAT 活性，但AML細胞中高表達的ANP32A促進H3組蛋白乙酰化，進而調控脂代謝基因表達，推動白血病發生。這個研究結果與最初體外ANP32A 抑制組蛋白乙酰化功能截然相反，提示ANP32A 在體內對組蛋白乙酰化修飾的作用可能與其招募的相互作用蛋白有關。為了進一步闡明ANP32A 調控組蛋白乙酰化的機制，研究人員進一步干預ANP32A 和H3 組蛋白的相互作用，結果顯示破壞ANP32A 和H3 組蛋白的相互作用能抑制AML 細胞增殖[97]。表明ANP32A 是AML 組蛋白乙酰化的重要輔助因子，通過ANP32A 干預組蛋白乙酰化有望成為AML 治療的新策略。

別名地丁、地丁草、紫花地丁、小雞菜、扁豆秧，為罌粟科植物紫堇的干燥全草，夏季花果期采收，除去雜質，曬干。主要分布于遼寧、河北、內蒙古、山東、山西、陜西、甘肅、寧夏等。

5 展望

盡管組蛋白乙酰化在基因表達激活以及開放染色質結構中的功能已經非常明確，但其在白血病發生中的功能及其在白血病治療中的潛在作用并未得到充分闡釋，特別是白血病發生過程中組蛋白乙酰化穩態的動態變化規律有待進一步闡明，而通過研究不同類型AML 病人原代細胞和構建相應的動物模型可以進一步揭示其中的變化規律。現有的研究表明抑制組蛋白乙酰化和抑制組蛋白去乙酰化都能達到白血病治療效果，提示白血病細胞中組蛋白乙酰化的穩態失衡是關鍵因素，而組蛋白乙酰化水平本身的影響較小。因此，后續研究有必要闡明組蛋白乙酰化水平與AML 各個亞類的相關性，明確不同亞類AML 對組蛋白乙酰化抑制劑或組蛋白去乙酰化抑制劑敏感性的差異，從而科學判斷抑制劑的選擇。

另外，發展靶向組蛋白乙酰化的AML 治療依然面臨多重挑戰。盡管其機制仍未得到充分探索，但已有證據表明白血病對表觀遺傳療法也會產生抗性，其中最典型的是對BET 抑制劑的抗性。因此，開展多種療法組合是提高AML 治療效果的有效途徑，可以選擇與常規化療、靶向療法、其他表觀遺傳療法甚至免疫療法進行組合優化，以期達到提高療效的目的[98]。有報道指出許多HAT 小分子抑制劑生物利用度低和特異性差，且具有抗氧化或不穩定性等細胞內特性，極大阻礙了HAT 抑制劑在臨床上的應用。因此，持續研究和測試優化影響HAT 和組蛋白乙酰化“閱讀器”的化合物，將有助于使用此類分子的療法設計以用于臨床試驗。但是，靶向組蛋白乙酰化的AML 治療的更大挑戰在于靶向組蛋白乙酰化系統的復雜性，因為該系統是大規模整合的多個蛋白質和多個單一底物的復合物，而靶向復合物中單個蛋白的單個結構域小分子很可能無效，尤其是在復合物中多個蛋白存在功能冗余的情況下。不可忽視的是，該系統中存在類似ANP32A 的“輔助”蛋白作為功能刺激蛋白影響HAT 活性及其生理病理功能的發揮。所以，未來開展系統性的研究鑒定這類相關功能蛋白，可能為該干預策略拓展思路，并提供更多的靶向分子，以期提高治療效果。