亞硝基胍-紫外復合誘變選育高產衣康酸菌株

杜敬彩，趙剛，李自云，許國峰，張成虎*

（1.山東泓達生物科技有限公司，山東臨沂 276400；2.山東沂蒙山酒業有限公司，山東臨沂 276400）

衣康酸學名為甲叉琥珀酸、亞甲基丁二酸，是不飽和二元有機酸。因為衣康酸分子內含一個不飽和雙鍵，化學性質活潑，可進行自聚合，也能與其他有機物共聚。衣康酸具有兩個羧基，還可以與醇發生酯化反應。平臺化合物是指可進一步轉化為價值更高的目標化工產品的基礎化學物，2004 年，衣康酸被美國能源部評選為12 種最具發展潛力的生物基平臺化合物之一[1]。衣康酸酯類是生產腈綸、樹脂、塑料、橡膠、藥物、表面活性劑、無毒食品包裝材料、除草劑、除垢劑、粘著劑、除臭劑、紙張等的工業原料，廣泛用于化工行業[2-3]。因此，衣康酸是化學合成工業的重要原料，也是化工生產的重要原料。

衣康酸的生產方法主要有化學法和生物法，相比化學法生產衣康酸，生物發酵法具有原料來源豐富、成本較低、反應條件溫和、環境友好、工藝技術成熟等優點，因此生物發酵法是目前衣康酸生產的主流方向。近年來報道的微生物發酵法生產衣康酸的主要菌種包括土曲霉[4]（Aspergillus terreus）、玉米黑粉菌[5]（Ustilago maydis）、黑曲霉[6]（Aspergillus niger），這些菌株產生的衣康酸可自主分泌到胞外。目前，土曲霉（Aspergillus terreus）仍然是應用最廣泛的衣康酸工業生產菌株，但菌種產量較低、產酸不穩定成為制約衣康酸生物發酵產業快速發展的重要因素。因此，利用傳統誘變育種或基因重組對菌種進行改良已成為衣康酸生產領域的重要研究方向。

傳統的物理、化學誘變方法可以促進誘發突變，提高突變率，并且因其便捷、快速、有效等優點，迄今為止仍是國內外提高菌種產量、性能的主要手段。誘變方法不同對菌株產生的誘變效應也不同。如紫外誘變是一種常用的物理誘變因素，可使DNA 形成嘧啶二聚體[7]，而亞硝基胍（NTG）是烷化劑的一種，被喻為“超誘變劑”[8]，它主要在DNA 鏈的復制區引起GC →AT 的轉換，即使在致死率很低的條件下也能使微生物產生高頻率的突變。單一誘變方法雖可得到高產菌株，但突變概率偏低；復合誘變具有協同效應，比單一誘變效果好[9]。

本研究采用亞硝基胍-紫外復合誘變對本實驗室一株產衣康酸菌株進行菌種選育，加大菌株突變率，有效提高高產菌株的選育效率，并對高產菌株的遺傳穩定性進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

土曲霉KYK-031，本實驗室篩選保藏。

1.1.2 培養基

（1）傳代斜面培養基：葡萄糖20.0 g/L，胰蛋白胨1.0 g/L，玉米漿3.0 g/L，硫酸鎂1.0 g/L，磷酸二氫鉀0.5 g/L，瓊脂20.0 g/L，pH 自然。

（2）種瓶培養基：葡萄糖40.0 g/L，硫酸銨5.0 g/L，玉米漿2.5 g/L，硫酸鎂1.0 g/L，磷酸二氫鉀0.5 g/L，硝酸調pH 值至3.0。

（3）搖瓶培養基：葡萄糖130.00 g/L，硫酸銨5.00 g/L，玉米漿2.50 g/L，硫酸鎂1.00 g/L，磷酸二氫鉀0.50 g/L，硫酸亞鐵0.01 g/L，硫酸鋅0.01 g/L，氯化鈣0.50 g/L，硝酸調pH 值至3.0。

（4）初篩顯色平板培養基：葡萄糖100.00 g/L，硫酸銨5.00 g/L，玉米漿2.50 g/L，硫酸鎂1.00 g/L，磷酸二氫鉀0.50 g/L，硫酸亞鐵0.01 g/L，硫酸鋅0.01 g/L，溴甲酚綠0.10 g/L，瓊脂20.00 g/L。

1.1.3 試劑

亞硝基胍，分析純，上海源葉生物科技有限公司；溴甲酚綠，分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司；胰蛋白胨，生化試劑，國藥集團化學試劑有限公司；玉米漿，生化試劑，魯洲生物科技（山東）有限公司；瓊脂，生化試劑，上海沃凱藥業有限公司；酚酞，分析純，天津市北辰區方正試劑廠；其余試劑均為國藥集團化學試劑有限公司生產的分析純試劑。

1.1.4 儀器與設備

ZWY-2112B 型恒溫搖床、ZXDP-B2270 型電熱恒溫培養箱和ZHJH-C1112C 型超凈工作臺，上海智城分析儀器制造有限公司；LDZM-80L-Ⅱ型立式高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫療器械廠；SBA-40E 型生物傳感分析儀，山東省科學院生物研究所。

1.2 實驗方法

1.2.1 單孢子懸液制備

甘油管菌種接種新鮮斜面培養基，37 ℃培養6 ～7 d，待長出孢子，取出斜面加入6 mL 磷酸緩沖液（0.1 mol/L，pH 6.0），用接種環刮下孢子，振蕩試管立即通過帶濾紙漏斗過濾，調整孢子懸液的濃度為106個/mL，得到單孢子懸液[10]。

1.2.2 亞硝基胍（NTG）溶液的制備

使用磷酸緩沖液（0.1 mol/L，pH 6.0）配制1 mg/mL亞硝基胍溶液，于暗處振蕩溶解后備用。

1.2.3 亞硝基胍誘變

亞硝基胍溶液與單孢子懸液以1 ∶1 的體積比例混合，30 ℃振蕩20 ～60 min，20 min 時取樣1 次，之后每10 min 取樣1 次，取樣后立即稀釋1 000 倍終止反應；梯度稀釋后，于初篩顯色平板進行分離培養，37 ℃培養3 d 后計數。未處理的單孢子懸液與pH 6.0的磷酸緩沖液以1 ∶1 的體積比例混合，梯度稀釋后于初篩顯色平板進行分離培養，37 ℃培養3 d 后計數。

根據處理前后的孢子數按公式（1）計算致死率。根據Hc 值（變色圈直徑與菌落直徑的比值），處理后的單菌落比處理前的單菌落Hc值高的為正突變菌株，按公式（2）計算正突變率。

式中：B0和By分別為每1 mL 未處理和誘變處理孢子液中孢子數；J為每1 mL 對照組菌液中菌株數。

1.2.4 紫外誘變

取單孢子懸液8 mL 至直徑為9 cm 的無菌培養皿中，置于磁力攪拌器上，15 W 紫外線下30 cm 處。在正式照射前，應先開啟紫外燈預熱10 ～20 min，待光波穩定后，開啟皿蓋和磁力攪拌，分別照射1 min、2 min、3 min、4 min 和5 min。操作全過程在紅燈下進行，避免白熾光。誘變單孢子懸液放入黑暗冰箱中保存1 h，抑制突變體中的修復酶活，提高誘變突變率。取未照射的制備孢子液和照射后冰箱保存的孢子液各1 mL，梯度稀釋至合適濃度，取0.1 mL 單孢子懸液均勻涂布于初篩顯色平板，于37 ℃避光培養3 d。計算致死率和正突變率。

1.2.5 亞硝基胍-紫外復合誘變

以亞硝基胍和紫外線誘變的最佳參數進行復合誘變。取經亞硝基胍誘變的單孢子懸液8 mL 至直徑為9 cm 的無菌培養皿中，進行紫外誘變，稀釋分離后涂布于初篩顯色平板，于37 ℃避光培養3 d。根據孢子液中活孢子數和Hc 值，以未經處理的單孢子懸液為對照，計算致死率和正突變率。

1.2.6 篩選方法

（1）平板初篩

衣康酸單菌落生長過程中產生衣康酸，滲透進周圍培養基中，導致pH 降低，初篩顯色平板在溴甲酚綠酸堿指示劑的作用下，藍綠色的平板上產生黃色變色圈，根據初篩顯色平板上的Hc 值，選取10%的高產菌株傳代于試管斜面培養基，37 ℃下恒溫培養箱培養3 d 進入復篩。

（2）搖瓶復篩

將平板初篩獲得菌株斜面孢子接種瓶培養基，37 ℃下200 r/min 回旋式搖床培養36 h，按10%接種量轉接搖瓶培養基，500 mL 三角瓶裝液量為60 mL，每株菌株做3 個平行，在37 ℃下200 r/min 回旋式搖床培養3 d。

（3）誘變篩選路線

根據選定誘變條件，確定如下誘變路線[11]。第一輪：以土曲霉HYK-031 為出發菌株，經亞硝基胍-紫外復合誘變后，初篩顯色平板上根據Hc 值從500 株顯色菌株進行初篩，選取50 株Hc 值較大菌株進行搖瓶復篩，篩選出5 株高產菌株。第二輪：分別以5 株高產菌株為出發菌株，每株出發菌株經亞硝基胍-紫外復合誘變后，分別從初篩顯色平板上長出的100 株顯色菌株（共500 株）中進行初篩，選取50 株Hc 值較大菌株進行搖瓶復篩，篩選出5 株高產菌株。第三輪：與第二輪步驟相同。第四輪：與第三輪步驟相同。

1.2.7 高產突變株遺傳穩定性考察

將亞硝基胍-紫外復合誘變后復篩選育的衣康酸高產菌株，連續傳5 代，并將5 代全部進行搖瓶發酵驗證，根據發酵結果確定高產菌株的遺傳穩定性。

1.2.8 分析方法

（1）衣康酸含量檢測

發酵完畢，取出搖瓶加水恢復至原體積60 mL，取發酵液用濾紙進行過濾后，稱取濾液0.2 g，精確到0.2 mg，用約50 mL 水溶解并全部移入250 mL 錐形瓶中，加酚酞指示液2 ～3 滴，以0.1 mol/L 氫氧化鈉標準滴定溶液滴定至淡粉色，并保持30 s不褪色為終點，記錄消耗氫氧化鈉標準滴定溶液的體積V1，同時做空白試驗，記錄消耗氫氧化鈉標準滴定溶液的體積V2。衣康酸質量分數W按公式（3）計算。

式中，c為氫氧化鈉標準滴定溶液的準確濃度，mol/L；65.05 為衣康酸的摩爾質量，g/mol；m為試樣的質量，g。

（2）糖酸轉化率

生物傳感分析儀檢測初始糖濃度和殘糖濃度，糖酸轉化率按公式（4）計算。

1.3 統計與分析

利用Excel 2007 軟件對數據進行平均數和方差的統計分析。

2 結果與分析

2.1 亞硝基胍誘變時間的確定

對出發菌株土曲霉KYK-031 進行亞硝基胍誘變后，計算致死率和正突變率，結果如圖1 所示。亞硝基胍在500 μg/mL 濃度下，隨著亞硝基胍誘變時間的延長，致死率逐漸升高，正突變率則先上升后下降。當亞硝基胍誘變時間為40 min 時，正突變率達到最高（15%），此時的致死率為81.6%。因此，選擇亞硝基胍誘變時間為40 min。

圖1 NTG 誘變的影響

2.2 紫外誘變時間的確定

對出發菌株土曲霉KYK-031 進行了紫外誘變后，計算致死率和正突變率，結果如圖2 所示。在相同紫外照射強度下，隨著誘變時間的延長致死率逐漸升高，正突變率則呈現先上升后下降的趨勢。當紫外誘變時間為2 min 時，正突變率達到最高（17.3%），此時的致死率為75.2%。因此，選擇紫外誘變時間為2 min。

圖2 紫外誘變的影響

2.3 亞硝基胍-紫外復合誘變

對出發菌株土曲霉KYK-031 進行亞硝基胍-紫外復合誘變，選擇亞硝基胍誘變濃度為500 μg/mL，亞硝基胍誘變時間為40 min，15 W 紫外線照射時間為2 min，亞硝基胍-紫外復合誘變后，進行致死率和正突變率的計算。三次重復實驗結果見表1，致死率達到93.5%，正突變率也達到了26.1%，比單一誘變正突變率高。

表1 亞硝基胍-紫外復合誘變對土曲霉的影響

2.4 高產菌株的篩選

以土曲霉KYK-031 為出發菌株，進行三輪亞硝基胍-紫外復合誘變后，根據平板初篩和搖瓶復篩結果，篩選出5 株衣康酸高產菌株KYK-1035、KYK-1165、KYK-1352、KYK-1483 和KYK-1494，搖瓶發酵產量結果如圖3 所示。KYK-1035 菌株搖瓶發酵衣康酸產量最高，為73.7 g/L，比出發菌株（41.8 g/L）提高了76.3%，糖酸轉化率為63.4%。

圖3 土曲霉突變株產量和糖酸轉化率

2.5 高產菌株的遺傳穩定性

篩選出的衣康酸高產菌株要符合生產菌株穩定性的要求。對篩選出的衣康酸高產菌株KYK-1035傳代5 次，對5 代菌株的遺傳穩定性進行考察，結果見表2。由結果可知，KYK-1035 菌株搖瓶發酵衣康酸的產量維持在72.4 ～73.9 g/L，糖酸轉化率維持在62.6%～63.6%，衣康酸產量和糖酸轉化率都較穩定，遺傳穩定性良好。

表2 土曲霉突變株KYK-1035 的遺傳穩定性

3 結論

通過對衣康酸出發菌株土曲霉KYK-031 進行傳統的化學、物理誘變，獲得高產衣康酸菌株。分別對亞硝基胍誘變和紫外誘變的致死率和正突變率進行研究，確定了亞硝基胍在500 μg/mL 濃度下的最佳誘變時間為40 min，15 W 紫外誘變的最佳誘變時間為2 min。最佳誘變條件下對土曲霉KYK-031 進行亞硝基胍-紫外復合誘變，比單一誘變的正突變率更高。進行三輪亞硝基胍-紫外復合誘變后，篩選出一株衣康酸高產菌株KYK-1035，搖瓶發酵衣康酸產量水平為73.7 g/L，比出發菌株（41.8 g/L）提高了76.3%，糖酸轉化率為63.4%。對KYK-1035 菌株進行遺傳穩定性驗證，該菌株穩定性良好，為今后的工業化生產奠定了基礎。后期將繼續對該菌株進行逐步放大優化，使其作為生產菌株更適應工業化生產。