陸地棉miR156 基因家族生物信息學分析及靶基因預測

王燕美

（1.深圳市光明區科技創新服務中心，廣東深圳 518000；2.中國科學院深圳先進技術研究院，廣東深圳 518000）

近年來，對植物miRNA 的功能研究發現，miRNA作為基因表達的負調控因子，在植物生長發育、信號轉導等各方面都發揮著重要作用[1]。陸地棉因其產量高、適應性廣而成為世界上最主要的棉花栽培種，目前針對陸地棉miR156 基因家族尚未進行系統鑒定和分析。本研究對陸地棉miR156 基因家族17 個成員進行了染色體定位、前體序列二級結構預測、成熟序列保守性分析、靶基因預測及表達模式分析，為揭示miR156 在陸地棉生長發育中的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

在Plant miRNA Encyclopedia 數據庫中下載陸地棉（Gossypium hirsutumL.）miR156 家族成員的前體和成熟序列及陸地棉7 個組織的轉錄組數據。

1.2 方法

用陸地棉miR156（Gh-miR156）家族成員的前體序列在Phytozome（https://phytozome-next.jgi.doe.gov/）中BLAST陸地棉基因組序列進行染色體定位。用WebLogo（http://weblogo.berkeley.edu/）網站分析Gh-miR156 成熟序列的保守情況。

用The UNAFold Web Server（http://www.unafold.org/）網站中的RNA Folding Form在線分析Gh-miR156家族成員前體序列的二級結構，參數選擇為系統默認值。用psRNATarget（http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/home）網站在線預測Gh-miR156 家族成員的靶基因，默認系統參數值，設定罰分1 及以下的基因作為靶基因，罰分越低代表預測的靶基因可信度越高。用EXCEL 2010 軟件將轉錄組中Gh-miR156 家族成員的RPM（Reads Per Million reads）值取對數后做圖，篩選出顯著性差異表達的miRNA。

2 結果與分析

2.1 Gh-miR156 家族序列分析及染色體分布

Gh-miR156 家族由17 個基因組成，長度為20 ～21 bp（見表1）。成熟序列比對表明，17 個成員的序列一致性很高，僅在5’端第1 個、第15 個和第22個核苷酸處存在差異（見圖1）。

圖1 Gh-miR156 成熟序列一致性分析

表1 陸地棉miR156 基因家族的成熟序列及其染色體定位

染色體定位分析發現，Gh-miR156 家族成員集中分布在A 亞組和D 亞組的4、5、6、7、13 號這5 條染色體上，其中Gh-miR156a 和Gh-miR156n，Gh-miR156f 和Gh-miR156g，Gh-miR156h 和Gh-miR156i 分別在A 亞組7 號、D 亞組13 號、A 亞組13 號染色體上成簇存在（見表1）。

2.2 Gh-miR156 前體序列的二級結構預測

Gh-miR156 家族17 個成員的前體序列長度不完全一致，長度為82 ～210 bp。二級結構預測結果表明，17 個Gh-miR156 成員都能形成穩定的莖環結構，除Gh-miR156p 成熟的miRNA 序列位于均3’端外，其他成員成熟的miRNA 序列均位于5’端。詳見圖2。

圖2 Gh-miR156 家族成員前體序列的二級結構

2.3 Gh-miR156 的靶基因預測

靶基因預測發現，17 個Gh-miR156 家族成員共有107 個靶基因，主要為SQUAMOSA 啟動子結合蛋白樣轉錄因子家族成員，即SPL 轉錄因子，且均由一個以上的Gh-miR156 家族成員靶向調控。說明Gh-miR156 家族調控靶基因SPL 的作用網絡是十分復雜的，暗示在陸地棉中Gh-miR156 通過調控此類靶基因參與發育調控。

2.4 Gh-miR156 的表達模式分析

表達模式分析表明，Gh-miR156 家族成員在陸地棉7 個組織中存在差異表達（見圖3）。Gh-miR156m、Gh-miR156o、Gh-miR156p、Gh-miR156q 在莖端中不表達，但在胚、纖維、葉和根中卻顯著高表達。Gh-miR156q 在纖維的表達量顯著高于其他成員，但在花藥的表達量顯著低于其他成員。以上結果表明Gh-miR156 家族成員通過動態表達參與陸地棉不同組織的生長發育過程。

圖3 Gh-miR156 家族成員的表達模式

3 討論與結論

目前，大量的研究表明miR156 在植物中作為一種正向調控因子，靶向SPL 轉錄因子，調控芽的分化、營養生長到生殖生長的轉換等過程。QIU 等[2]運用生物信息學方法在陸地棉中首次預測到Gh-miR156的靶基因是SPL 轉錄因子。直至2012 年，WANG 等[3]使用Solexa 高通量測序首次在基因組水平上鑒定到Gh-miR156，并證實了Gh-miR156 的一個靶基因是SPL9 轉錄因子，且在陸地棉早期階段抑制纖維發育。XUE 等[4]在伸長期的棉纖維中發現，Gh-miR156 通過介導其靶基因SPL9 mRNA 的剪切，負調控花青素合成相關基因的轉錄，從而導致纖維細胞中花青素的合成降低，促進過氧化氫的迸發，使纖維細胞終止伸長、轉入次生壁合成增厚期的發育。有趣的是，LIU 等[5]在海島棉中發現，抑制miR156 的功能將導致成熟纖維的長度縮短，表明miR156 可以促進纖維伸長。

本研究對陸地棉中17 個Gh-miR156 家族成員進行了生物信息學分析，并預測了靶基因，為后續通過實驗方法驗證Gh-miR156 家族成員在陸地棉生長發育中的調控功能提供了理論基礎。