香料作物油樟葉內(nèi)米曲霉菌的分離鑒定及抗菌活性研究※

●鄧夢玲 任 靜

（1.宜賓學(xué)院農(nóng)林與食品工程學(xué)部 四川 宜賓 644000；2.四川省油樟工程技術(shù)研究中心 四川 宜賓 644000）

油樟（Cinnamomum longepaniculatum（Gamble））是我國特有的樟科樟屬常綠喬木，由于其具有生長迅速、木制優(yōu)良、含豐富芳香油類物質(zhì)及抗逆性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，在四川宜賓地區(qū)廣泛種植，是當(dāng)?shù)刂饕慕?jīng)濟(jì)樹種之一，因此又稱“宜賓油樟”[1]。油樟的根、莖、葉及果實(shí)含有多種芳香油，是香料、日化等產(chǎn)品的重要原料。此外，油樟具有阻斷肝癌細(xì)胞的分裂增殖[2]、抗氧化[3]、抗炎和鎮(zhèn)痛抑菌[4]等藥用價(jià)值，其在醫(yī)藥和食品工業(yè)等方面的研究和應(yīng)用也取得到較大進(jìn)展。

植物內(nèi)生真菌是指其某一段或整個生活周期定殖于健康植物根、莖、葉、花、果實(shí)等組織中的一類微生物共生體，不對植物造成明顯損傷[5]。內(nèi)生真菌與植物間形成了互利互惠的共生關(guān)系，內(nèi)生真菌可產(chǎn)生具有生物活性的次級代謝產(chǎn)物，促進(jìn)植物生長和增強(qiáng)宿主抗逆性[6]，植物則為內(nèi)生真菌的生長發(fā)育提供了生態(tài)位[7]。油樟作為重要的香料作物，其內(nèi)生真菌的多樣性和功能研究也越來越受到關(guān)注，目前主要集中在內(nèi)生真菌的分離鑒定、多樣性、分布差異、對植物病原的抑制作用等方面，未見其對常見細(xì)菌性病原抑制作用的研究。由于人類及動物的細(xì)菌性疾病頻發(fā)及抗生素的濫用，細(xì)菌對抗生素的耐藥性越來越嚴(yán)重，甚至出現(xiàn)了超級耐藥菌，給人類公共衛(wèi)生安全帶來巨大威脅，而藥物殘留造成的食品安全問題也不可回避，尋求生態(tài)、健康、有效的抗菌新策略迫在眉睫。

在前期的研究中，油樟內(nèi)生真菌對植物性病原顯示出較好的抑制作用[8]，受此啟發(fā)，本試驗(yàn)采用組織塊分離法分離培養(yǎng)油樟葉內(nèi)生真菌，對其進(jìn)行分類鑒定，并探究其發(fā)酵產(chǎn)物對常見幾種細(xì)菌性病原菌的抗菌作用，旨在挖掘和評價(jià)其在細(xì)菌性疾病防治中的應(yīng)用潛力，為將來油樟內(nèi)生真菌的資源的開發(fā)和利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料 油樟葉采集于四川省宜賓市高縣月江森林經(jīng)營所，供試菌種金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌均由四川省油樟工程技術(shù)研究中心提供。

1.1.2 試劑 PDA培養(yǎng)基、PDB培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、MH培養(yǎng)基；真菌DNA提取試劑盒、Master Mix、DNA Marker均購自天根生化科技（北京）有限公司；PCR引物由北京擎科生物科技有限公司（成都分公司）合成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 內(nèi)生真菌的分離純化 將油樟葉經(jīng)流水沖洗后，無菌條件下用無菌水沖洗2～3次，75%酒精浸泡30 s，再用無菌水沖洗2～3次，2%次氯酸鈉溶液浸泡消毒5 min，最后用無菌水清洗5次。吸取200 μL最后一次洗脫水均勻涂布于PDA和LB培養(yǎng)基上。無菌條件下，用剪刀將滅菌后的組織周圍剪去，將葉剪成0.5 cm×0.5 cm大小的組織塊接種于PDA培養(yǎng)基，每個平板接種4個，每組3個重復(fù)，置于生化培養(yǎng)箱22℃培養(yǎng)7 d。以洗脫水涂布的平皿未長出菌落有效，將分離得到的內(nèi)生真菌進(jìn)行純化，純化完成后接種于PDA斜面培養(yǎng)基，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 分離菌的鑒定

1.2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定 觀察記錄菌落生長速度、菌落形態(tài)特征、產(chǎn)孢情況等，用顯微鏡觀察菌絲形態(tài)及其孢子結(jié)構(gòu)，結(jié)合真菌鑒定手冊進(jìn)行初步鑒定。

1.2.2.2 分子生物學(xué)鑒定 使用真菌DNA提取試劑盒提取分離菌的總DNA，選擇通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG- 3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）進(jìn)行PCR擴(kuò)增[9]。PCR反應(yīng)體系：ddH2O 8.5 μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，引物各1 μL，模板DNA 2 μL；PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min，94℃預(yù)變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)，72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠電泳后送北京擎科生物科技有限公司（成都分公司）測序。測序結(jié)果登錄到NCBI GenBank 數(shù)據(jù)庫中運(yùn)用 BLAST比對鑒定，并在NCBI中下載相似序列進(jìn)行菌種的系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.2.3 抗菌特性的測定 將純化的菌株接種于PDB液體培養(yǎng)基，在恒溫?fù)u床150 r/min培養(yǎng)7 d，將發(fā)酵液4℃離心2 min，吸取上清液，并用0.22 μm過濾器過濾，得到菌株發(fā)酵液。將5 mm空白濾紙片放入制備好的發(fā)酵液中浸泡24 h作為試驗(yàn)樣片，備用。將供試菌金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌分別接種于LB肉湯培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h，用無菌生理鹽水調(diào)整至1×106mL-1，分別吸取供試菌200 μL均勻涂布于MH瓊脂培養(yǎng)基制成菌平板，每種菌3個重復(fù)。使用無菌鑷子將試驗(yàn)樣片等距貼于菌平板，37℃培養(yǎng)24 h，游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑并記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生真菌的分離和鑒定

通過組織塊分離法從油樟葉分離純化得到一株內(nèi)生真菌，暫命名為YZ-1。菌株菌落形成較快，質(zhì)地疏松，嫩黃色（圖1-A）。在顯微鏡下，菌株分生孢子頭呈放射狀，頂囊近球形或燒瓶形，表面較粗糙，子囊分生孢子卵圓形，近檸檬形（圖1-B）。對照真菌鑒定手冊，YZ-1形態(tài)與霉菌屬真菌較為相似，初步鑒定其為霉菌屬真菌。

圖1 菌株YZ-1形態(tài)

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，在500～750bp左右出現(xiàn)目的條帶（圖2），將PCR產(chǎn)物送檢北京擎科生物公司，獲得序列登錄到GenBank 利用BLAST進(jìn)行同源序列比對，結(jié)果顯示其與曲霉屬真菌同源性較高。下載與菌株YZ-1序列同源性較高的核酸序列，通過MEGA 7.0軟件采用Neighbo r-joinng（NJ）構(gòu)建發(fā)育樹，如圖3所示，菌株YZ-1與曲霉屬米曲霉菌（Aspergillus oryzae）聚在同一分支，遺傳距離較近，結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，確定本次分離的油樟源內(nèi)生真菌為米曲霉菌。

圖2 菌株YZ-1 rDNA-ITS PCR擴(kuò)增電泳圖

圖3 菌株YZ-1的rDNA-ITS序列的N-J系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 抗菌特性的研究

由圖4可知，YZ-1菌株發(fā)酵液對蠟樣芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌具有抑菌活性，對大腸桿菌無抑菌活性，對金黃色葡萄球菌抗菌效果最好，經(jīng)測抑菌圈直徑達(dá)（12.1±0.3 mm）。

3 討論

目前，真菌的鑒定主要采用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類法和分子生物學(xué)方法。由于培養(yǎng)條件的差異，真菌產(chǎn)生的形態(tài)差異較大，如在人工培養(yǎng)條件不產(chǎn)生孢子，且形態(tài)學(xué)鑒定要求具備豐富的經(jīng)驗(yàn)，故宏觀的形態(tài)學(xué)鑒定缺乏準(zhǔn)確性[10]。本研究分離得到的菌株YZ-1結(jié)合形態(tài)學(xué)和ITS序列鑒定確定其為米曲霉菌，先前王濤等[8]研究證實(shí)油樟內(nèi)生真菌中確有曲霉屬真菌，與本研究結(jié)果一致。米曲霉是曲霉屬真菌的一個常見種，有學(xué)者從云南滇重樓、黑果枸杞中也曾分離得到。目前，已證實(shí)米曲霉菌含有多種藥理活性物質(zhì)，具有抗腫瘤、抗菌、免疫抑制、抗高血壓、神經(jīng)麻痹、酶抑制等作用[11]，盡管對其代謝產(chǎn)物認(rèn)知仍十分有限，但其發(fā)展?jié)摿σ呀?jīng)凸顯，未來在食品、醫(yī)藥和飼料工業(yè)中將有更好的應(yīng)用前景。

自1993年國外學(xué)者Stierle等[12]首次從紅豆杉內(nèi)生真菌分離得到一種萜類化合物具有抗腫瘤的活性后，越來越多的內(nèi)生真菌生物活性物質(zhì)不斷被發(fā)現(xiàn)。大量研究證實(shí)，植物內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生豐富的次級代謝產(chǎn)物，且多種有活性的成分已被純化鑒定，顯示了植物內(nèi)生真菌的潛在應(yīng)用價(jià)值。聶麗娟[13]證實(shí)米曲霉菌對金黃色葡萄球菌有明顯抑制作用。沈業(yè)壽等[14]也證實(shí)米曲霉的發(fā)酵產(chǎn)物中A3042對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌有抑菌活性。楊秀芬等[15]檢測到黑果枸杞源米曲霉RER4的發(fā)酵產(chǎn)物中含有對大腸桿菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌等具有抑制作用的物質(zhì)。本研究中，油樟源內(nèi)生真菌YZ-1的發(fā)酵液對蠟樣芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌具有抑制作用，而對大腸桿菌無明顯抑制作用。與聶麗娟、沈業(yè)壽、楊秀芬米曲霉菌中對金黃色葡萄球菌具抑制作用的研究結(jié)果一致，但菌株YZ-1對大腸桿菌無作用，究其原因是否與不同植物源內(nèi)生真菌的種間差異有關(guān)，還需進(jìn)一步研究。

本試驗(yàn)僅對米曲霉菌YZ-1發(fā)酵液對幾種常見細(xì)菌性病原抗菌特性進(jìn)行了初步探究，而該菌的發(fā)酵液是否具有廣譜抗菌活性，后期還需增加拮抗菌株的種類進(jìn)行進(jìn)一步研究。金黃色葡萄球菌是環(huán)境及臨床常見的細(xì)菌之一，其對抗生素的耐藥現(xiàn)象十分嚴(yán)重。本研究使用的是YZ-1菌株的發(fā)酵液，尚未進(jìn)行萃取和濃縮，其含有的抗菌成分濃度較低，后期將對YZ-1的培養(yǎng)條件進(jìn)行探索，篩選出抗菌效果最好的培養(yǎng)條件，進(jìn)行大規(guī)模發(fā)酵，并分離提純其中的抗菌化合物。