超聲波—發酵輔助提取玉竹黃酮的研究

李志清 王殿奎 張李莉 蔣曉蕊 孫 琛 孫金旭

（1 衡水市綜合檢驗檢測中心 河北 衡水 053000；2 衡水市質量與標準化研究院 河北 衡水 053000； 3 衡水學院 河北 衡水 053000）

玉竹為多年生草本植物，百合科黃精屬，2002 年3 月被國家衛生部列為藥食同源植物，其入藥部位為根莖，經研究其活性成分為黃酮、多糖、糖蛋白、皂甙等，目前已經報道的玉竹活性成分的功效有抗氧化、抗腫瘤、降血糖等[1～2]。

超聲波輔助提取具有省事、省力、高效、環保的特點，在現代提取技術中應用廣泛[3]；發酵提取法利用的是菌發酵過程中產生的多種代謝產物和酶系對植物細胞壁破壞效果明顯的特點[4]。本文研究超聲波—發酵輔助提取玉竹活性物質黃酮優化提取工藝，為玉竹黃酮工業化提取提供支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料。玉竹(購自北京同仁堂衡水分店)，蘆丁標準品(購于國家標準物質網)，菌種(衡水學院生命科學系菌種室保藏)。

1.2 儀器設備。破壁機(深圳市凈品環保科技有限公司)，電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)，分光光度計(722G 可見分光光度計，廣州廣一科學儀器有限公司)，超聲波提取儀(MHY-25045，北京美華儀科技有限公司)。

1.3 黃酮提取方法

1.3.1 普通提取法。玉竹破壁機粉碎后，過60 目篩，按照1∶5 的料液比例進行配比，混勻后，逐漸加熱升溫至80 ℃，保溫提取2 h。

1.3.2 超聲提取法。玉竹破壁機粉碎后，過60 目篩，按照1∶5 的料液比例進行配比，混勻后，進行超聲提取，提取功率200 W，時間15 min。

1.3.3 發酵提取法。玉竹破壁機粉碎后，過60 目篩，按照1∶5 的料液比例進行配比，混勻后，按1%添加葡萄糖，煮沸滅菌20min，接種按工藝接種目標菌發酵培養。

1.3.4 超聲—發酵輔助提取法。玉竹破壁機粉碎后，過60 目篩，按照1∶5 的料液比例進行配比，混勻后，按1%添加葡萄糖，進行超聲提取，提取功率200 W，時間15 min，煮沸滅菌20 min，接種按工藝接種目標菌發酵培養。

2 結果與分析

2.1 超聲波—發酵輔助提取玉竹黃酮發酵菌種的選擇。經粉碎處理后的玉竹，按照1∶15 的料液比例配成渾濁液，超聲提取20 min 后，分裝于4 個1 L 的三角瓶中，每個瓶中裝液量600 ml，滅菌20 min 后，冷卻至室溫，分別無菌接種枯草芽孢桿菌、酵母菌、保加利亞乳桿菌、木醋桿菌，活化后菌液接種量占料液體積的1%，分別發酵培養36 h，發酵結束后過濾取液體，測定黃酮提取量，結果如圖1 所示。由圖1 可知，雖然相對于普通提取和超聲提取，各菌株發酵后對玉竹黃酮的提取都有不同程度的提高，但相對來說枯草芽孢桿菌發酵下，玉竹黃酮提取量最高，因此選擇枯草芽孢桿菌作為超聲—發酵輔助提取玉竹黃

圖1 超聲波— 發酵輔助提取菌種選擇

酮的發酵菌株。

2.2 接種量對超聲—發酵輔助提取玉竹黃酮的影響。經超聲處理后的玉竹，分別分裝于8 個1 L 的三角瓶中，裝液量600 ml，滅菌冷卻至室溫，按照不同接種量無菌接種經活化好的枯草芽孢桿菌，發酵36 h 后，測定玉竹黃酮提取量。由圖2 可知，枯草芽孢桿菌接種量對玉竹黃酮提取量有一定的影響，低比例接種量條件下，玉竹黃酮提取量較低，隨著接種量的增大，玉竹黃酮提取量隨之增加，枯草芽孢桿菌接種量為2.5%時，玉竹黃酮提取量最高，之后隨著接種量的增加，玉竹黃酮提取量呈現降低的趨勢，因此，確定接種量為2.5%較為適宜。

圖2 接種量對超聲— 發酵輔助提取的影響

2.3 發酵溫度對超聲—發酵輔助玉竹黃酮提取量的影響。經超聲處理后的玉竹，分裝于6 個1 L 的大三角瓶中，裝液量600 ml，滅菌后冷卻至室溫，按照2.5%的比例無菌接種，分別在24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃下發酵培養36 h，之后過濾出液體，測定玉竹黃酮提取量。由圖3 可知，不同發酵溫度下，枯草芽孢桿菌對玉竹黃酮提取量不同，低溫不利于玉竹黃酮的提取，隨發酵溫度的提高，玉竹黃酮提取量增加，當發酵溫度為28 ℃時，玉竹黃酮提取量最高，之后隨溫度升高，玉竹黃酮提取量降低，分析原因可能是28 ℃為該培養條件下枯草芽孢桿菌的適宜發酵生長溫度，菌體大量快速地繁殖后，代謝產物增多，產生的酶等物質豐富，有利于破壁，因此確定28 ℃為發酵提取溫度。

圖3 發酵溫度對玉竹黃酮提取量的影響

2.4 發酵時間對超聲—發酵輔助玉竹黃酮提取量的影響。經超聲處理好的玉竹黃酮，裝于3 L 的三角瓶中，裝液量1.8 L，滅菌后，冷卻至28 ℃，按2.5%的接種量無菌接種枯草芽孢桿菌，發酵培養，每8 h 取樣測定玉竹黃酮提取量。由圖4 可知，玉竹黃酮提取量隨發酵時間的增加而增大，這也與枯草芽孢桿菌的生產繁殖有關，培養到48 h，玉竹黃酮提取量最高，之后降低，表明48 h 菌體生長繁殖達到最旺盛期，代謝產物及酶系最為豐富，破壁效果最好。

圖4 發酵時間對玉竹 黃酮的影響

2.5 幾種玉竹黃酮提取方法對比分析。根據玉竹黃酮提取量，對比分析普通提取、超聲提取、發酵提取、超聲—發酵輔助提取玉竹黃酮方法，發現超聲—發酵輔助提取＞發酵提取＞超聲提取＞普通提取，優化后測得超聲—發酵輔助提取玉竹黃酮提取量達到47.29 mg/g，相對于普通熱水浸提(13.21 mg/g)提高2.58 倍，相對于發酵提取(34.28 mg/g)提高37.95%，相對于超聲提取(22.35 mg/g)提高1.12 倍，表明超聲—發酵輔助提取玉竹黃酮是非常行之有效的方法。

圖5 不同提取方式對比分析

3 結論與討論

利用超聲波—發酵輔助提取玉竹黃酮，對菌種、接種量、發酵溫度、發酵時間等工藝參數進行優化，優化后的超聲波—發酵輔助提取玉竹黃酮的工藝條件為：玉竹渾濁液先進行超聲處理再進行發酵，發酵菌種為枯草芽孢桿菌，發酵溫度28 ℃，接種量2.5%，發酵時間48 h，此條件下，玉竹黃酮提取量達到47.29 mg/g，相對于普通熱水浸提(13.21 mg/g)提高2.58 倍，相對于發酵提取(34.28 mg/g)提高37.95%，相對于超聲提取(22.35 mg/g)提高1.12 倍，表明超聲—發酵輔助提取玉竹黃酮是非常行之有效的方法。