負載雙氯芬酸鈉的間充質干細胞外泌體對類風濕關節炎小鼠治療的研究

王 喆，于海寬，孟佳琦，文 山，張傳杰，梅晰凡錦州醫科大學附屬第三醫院骨科，遼寧 錦州 00；遼寧省醫學組織工程重點實驗室，遼寧 錦州 00；解放軍醫學院，北京 0085；中國科學院大學，北京 0009

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以炎癥和關節破壞為主要表現的慢性炎癥性關節疾病，影響著全球約1%的人口，其中以中老年女性為主[1-2]。部分患者關節破壞較為嚴重，可引起關節畸形甚至殘疾，嚴重影響個人和家庭的生活質量[3-4]。目前針對類風濕關節炎的主要治療措施是控制炎癥以延緩疾病的發展[5]。盡管用于治療類風濕關節炎的藥物很多，包括非甾體抗炎藥、改善病情藥物、生物制劑和靶向小分子藥物，但仍有一些難治性類風濕關節炎患者對多種藥物治療反應差[6-8]。外泌體(exosome，EXs)是由細胞分泌的直徑為40 ~ 160 nm 的囊泡，在細胞與細胞間或細胞與組織間的信號傳導中發揮重要的作用[9]。EXs 具備良好的生物相容性和較低的細胞毒性，這使其成為一種良好的藥物運輸載體[10-11]。間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs) 來源的EXs 除了具備以上特點，還繼承了MSCs 的修復損傷細胞或組織的特性[12]。本研究利用MSCs 來源的EXs，并將抗炎藥物雙氯芬酸鈉(diclofenac sodium，DS)裝載入其中，觀察其對類風濕關節炎模型小鼠的治療效果，為類風濕關節炎乃至其他炎癥性關節疾病的治療進行探索。

材料與方法

1 實驗動物 DBA 小鼠(6 ~ 8 周，體質量18 ~22 g) 100 只，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，并在SPF 級別的動物房中飼養(溫度20 ~22°C；濕度40% ~ 60%)，在12 h 光照/12 h 黑暗循環下，自由獲取食物和水。

2 試劑和儀器 MEM α 培養基、青霉素/鏈霉素雙抗、胰蛋白酶、完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑、Ⅱ型膠原(賽默飛世爾科技公司)；胎牛血清(Gibco 公司)；磷酸鹽緩沖液、小鼠白細胞介素(interleukin，IL)-6 ELISA 試 劑 盒、小 鼠IL-1β ELISA 試劑盒、小鼠腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF) ELISA 試劑盒、DAPI、紅細胞裂解液(北京索萊寶科技有限公司)；Anti-CD9、Anti-CD63 (Abcam)；雙氯芬酸鈉(Sigma-Aldrich)；納米顆粒追蹤分析(Particle Metrix 公司)；透射電子顯微鏡(JOEL 公司)；micro-CT (Caliper 公司)；冰凍切片機(Leica 公司)；激光共聚焦顯微鏡(Nikon 公司)。

3 間充質干細胞的提取 間充質干細胞從60 只小鼠長骨的骨髓中提取。頸椎脫位法處死DBA 小鼠，將其浸泡至75%乙醇中。轉移小鼠至無菌操作臺并進行固定，使用剪刀與鑷子暴露出股骨和脛骨的骨干，使用注射器在骨干處鉆孔并用預冷的MEM α 培養基沖洗骨髓腔3 ~ 4 次，然后300 g離心5 min。丟棄上清液，將5 mL 紅細胞裂解物加入沉淀中并重懸，室溫孵育3 min。300 g 離心5 min，棄上清，最終得到骨髓細胞，在含10%胎牛血清和1% 青霉素-鏈霉素的MEM α 培養基中培養。

4 外泌體的提取和表征 將收集到的MSCs 上清分別在300 g 和2000 g 下離心10 min。將得到的上清液10000 g 離心30 min。再將獲得的上清液100000 g 下超速離心兩次，以獲得外泌體。通過透射電鏡觀察外泌體的形貌，納米顆粒追蹤儀分析外泌體的粒徑和電位，免疫印跡法檢測表面蛋白CD9 和CD63。

5 外泌體內裝載雙氯芬酸鈉 將1 mg 雙氯芬酸鈉均勻分散在1 mL Tris-HCl 緩沖液(pH 8.5)，配制成雙氯芬酸鈉溶液。配制300 μg/mL 的外泌體溶液。將雙氯芬酸鈉溶液加至外泌體溶液中進行超聲處理，超聲功率為120 W，On/Off 各20 s。每進行1 次處理后置于冰浴1 min，重復3 次上述操作。超聲結束后將溶液置于37℃的水浴中孵育1 h。孵育結束后超濾柱除去多余的藥物分子。

6 類風濕關節炎模型小鼠的構建 將完全弗氏佐劑和Ⅱ型膠原等體積混合并制成均勻的乳劑，在40 只DBA 小鼠尾部的皮下注射100 μL 乳劑。21 d后，使用同樣的方式將100 μL 不完全弗氏佐劑與Ⅱ型膠原混合后的乳劑注入小鼠尾部皮下。28 d時對小鼠進行評分[13]。評分＞4 分的小鼠視為模型初步構建成功并入組。評分標準如下：0 分，正常；1 分，局限于足中部和腳踝關節的輕度腫脹和紅斑；2 分，輕度腫脹和紅斑從足中延至腳踝關節；3 分，中度腫脹和紅斑從足趾關節延伸到腳踝；4 分，嚴重腫脹和紅斑覆蓋足部、腳踝和腳趾。之后對不同治療組小鼠的足踝部每3 d 進行1 次評分。

7 外泌體靶向分析 將100 μL DIO 標記的EXs和脂質體通過尾靜脈注射到類風濕關節炎模型小鼠體內。4 h 后截取小鼠的關節部位，于甲醛溶液中固定2 d。然后再進行脫鈣2 周。使用OCT 膠對關節進行包埋，將其切成8 μm 的薄片。清洗后使用DAPI 核染，激光共聚焦觀察DIO 標記的外泌體在關節處的聚集。

10 統 計 學 分析 數 據 采 用GraphPad Prism 9.0進行計算和統計。計量數據以xˉ±s表示，兩組比較采用t檢驗，多組比較采用單因素方差分析。P＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1 DS@EXs 的 表 征 透 射 電 鏡 觀 察 到EXs 和DS@EXs 的形態均呈典型的茶托樣(圖1A)。EXs粒徑保持在100 nm 左右并且電勢維持在-12 mV 左右，在EXs 中裝載DS 后，粒徑和電勢均未發生明顯變化(圖1B，圖1C)。Western blot 檢測EXs表面的標志性蛋白CD9 和CD63，在裝載DS 后兩種蛋白仍有表達(圖1D)。提示在裝載DS 后，并未對EXs 的基本性質造成影響。

圖1 DS@EXs 的表征A：EXs 和DS@EXs 的透射電鏡圖像；B：EXs 和DS@EXs 的粒徑；C：EXs 和DS@EXs 的電勢；D：通過Western blot 對EXs 和DS@EXs 標志物(CD9 和CD63)的分析Fig.1 Characteristics of DS@EXs A: TEM images of EXs and DS@EXs; B: Particle sizes of EXs and DS@EXs; C: Zeta potentials of EXs and DS@EXs; D: Western blotting analysis of the markers (CD9 and CD63) of EXs and DS@EXs

2 DS@EXs 在小鼠體內靶向性 將DIO 標記的脂質體和DS@EXs 通過尾靜脈注射至類風濕關節炎模型小鼠體內，4 h 時收集膝關節樣本，免疫熒光分析脂質體和DS@EXs 的分布。由于脂質體對炎癥部位無靶向性，因此在關節腔中的聚集較少。而DS@EXs 具有靶向性，在關節處的聚集更加明顯(圖2A)。定量分析顯示DS@EXs 在關節處的聚集高于脂質體(P＜0.05，圖2B)。

圖2 DS@EXs 的體內靶向能力A：脂質體和EXs 在小鼠關節中的聚集；B：圖A 的熒光定量Fig.2 Targeting ability of DS@EXs in mice A: Accumulation of liposomes and EXs in the joint of mice;B: Fluorescence quantification of figure A

3 DS@EXs 的抗炎效果 類風濕關節炎模型小鼠的關節炎評分隨著病程的發展逐漸升高。接受了游離DS 或EXs 治療的小鼠，關節炎評分均輕微下降。而接受DS@EXs 治療的小鼠，關節炎評分顯著下降(P＜0.05，圖3A)。43 d 時，與PBS 組相比，DS@EXs 組IL-6、IL-1β 和TNF 的水平分別下降了52.8%、63.8%和52.5% (P＜0.05，圖3B)。

圖3 DS@EXs 的抗炎效果A：治療結束后各組小鼠關節炎評分；B ~ D：各組小鼠血清中炎癥因子的水平Fig.3 Anti-inflammatory effect of DS@EXs A: Arthritis score of mice in each treatment group at the end of the therapy; B - D: The levels of inflammatory cytokines in serum of mice from each group

4 DS@EXs 對關節的保護作用 Micro-CT 圖像顯示，與游離DS 組和EXs 組相比，DS@EXs 顯著減弱了骨侵蝕(圖4A)。類風濕關節炎模型小鼠經過DS@EXs 治療，骨礦物質密度顯著上升，達1195.03 mg/cm3(P＜0.05，圖4B)。提示DS@EXs可以有效減緩關節的損傷。

圖4 DS@EXs 對關節的保護A：在實驗終點各組的小鼠踝關節micro-CT 圖像；B：各組踝關節骨礦物質密度比較Fig.4 Protective effect of DS@EXs on joint A: Micro-CT images of ankle joints at the endpoint of the experiment from each group; B: Comparison of bone mineral density from each group

討 論

盡管RA 的病因未明，但其顯著的特征之一就是持續的炎癥[14]。大量的免疫細胞在發病過程中涌入關節腔，包括中性粒細胞、巨噬細胞、效應T 細胞和B 細胞，通過釋放炎癥因子(如IL-6、IL-1β 和TNF)和一些小分子物質(如前列腺素和活性氧)，引起滑膜增生以及彌漫性炎癥[15-16]。關節軟骨在關節中起到潤滑和減震的作用，而增生的滑膜會對軟骨進行破壞，促進Ⅱ型膠原的降解，使其失去本有的力學性能[17-18]。IL-1β 可以抑制軟骨細胞蛋白多糖的合成，還能刺激一些蛋白降解酶的產生[19]。骨侵蝕同樣也是RA 的另一個重要特征[20]。骨侵蝕很大程度上與破骨細胞有關，而在這個過程中，炎癥因子起到了激活破骨細胞的作用，進而導致關節的進行性破壞[21]。因此，阻斷炎性反應的發展或清除炎癥因子都被視為控制RA 的有效措施[22]。

在過去十幾年的探索中，EXs 逐漸成為一種理想的藥物運輸載體，通過將不同的藥物、小分子蛋白以及治療性的核酸裝載到EXs 中，靶向遞送至特定的細胞或者組織中，同時還能減少因在其他部位藥物聚集而引起的不良反應[23]。Tian 等[24]證明連接單抗的外泌體可以有效抑制老年黃斑疾病的炎癥，并且未對小鼠造成明顯的不良反應。Wang 等[25]通過外泌體有效抑制腫瘤轉移和腫瘤復發。MSCs 來源的EXs 還可以促進損傷部位的修復，包括骨與軟骨。Li 等[26]發現MSCs 來源的EXs 可以減弱腰椎小關節骨性關節炎模型小鼠軟骨與軟骨下骨的損傷。還有研究發現，MSCs來源的EXs 可以上調軟骨細胞中聚集蛋白聚糖、SOX9、COL9A1 和COL2A1 的表達，同時下調MMP13 的表達以保護軟骨[27]。

本研究通過將非甾體抗炎藥物DS 裝載入MSCs 來源的EXs，以構建高效治療RA 的藥物遞送體系。一方面，DS@EXs 能夠將DS 運輸至關節損傷處以發揮抗炎功效，通過關節炎評分可以看出，由于局部藥物濃度的提升，足部的紅腫較DS 組有明顯的緩解；此外，炎癥因子的降低也充分展示了DS@EXs 的高效抗炎能力。另一方面，通過EXs 發揮修復損傷關節的作用，micro-CT 圖像清晰地展示了經過DS@EXs 的治療，關節的破壞有所減緩。

在DS@EXs 的基礎上，有望通過進一步的化學修飾或基因工程以加強其靶向性和抗炎功效，或根據疾病的病理特征賦予其新的治療作用。如將抗風濕藥物連接至外泌體表面也能夠加強藥物的靶向遞送，或通過轉染使得MSCs 過表達修復因子，進而使其分泌的外泌體包含更多的修復因子。另外，DS@EXs 還有望運用至其他炎癥性疾病，如骨關節炎，這將有利于進一步擴大DS@EXs 的應用場景。這意味著其應用潛力是值得挖掘的。DS@EXs 的成功構建，為后續開發和推廣奠定重要基礎。隨著進一步的研究，基于外泌體的應用將會更加廣泛，對疾病的體內跟蹤、預后監測和靶向治療具有深遠的意義。

作者貢獻梅晰凡：構思、設計研究，稿件修訂；王喆：完成整體實驗，撰寫初稿；于海寬、孟佳琦：協助對數據進行分析和研究；文山：協助實驗方法的改進；張傳杰：協助動物模型的構建。

利益沖突所有作者聲明無利益沖突。

數據共享聲明本篇論文相關數據可依據合理理由從作者處獲取，Email：wangzheglow@163.com。

5I ngegnoli F， Cavalli S， Giudice L， et al. Caffeine and rheumatoid arthritis：a complicated relationship［J］. Autoimmun Rev，2022，21（7）： 103117.

6B uch MH，Eyre S，McGonagle D. Persistent inflammatory and non-inflammatory mechanisms in refractory rheumatoid arthritis［J］. Nat Rev Rheumatol，2021，17（1）： 17-33.

10晏 梓鈞，茹楠，蔡夢溪，等. 外泌體改造和修飾研究進展［J］.解放軍醫學院學報，2019，40（12）： 1203-1206.