miR-145-5p 在正常大鼠與2 型糖尿病大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化中的表達(dá)比較

戴雅文，鄂玲玲，鄭 穎，馬小草，張 戎，時(shí) 權(quán)，劉洪臣解放軍總醫(yī)院研究生院，北京 00853；解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心口腔醫(yī)學(xué)研究所、口腔頜面戰(zhàn)創(chuàng)傷軍隊(duì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 00853

全球超過5 億人患有糖尿病，其中2 型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)約占90%[1]。T2DM 可引起一系列并發(fā)癥，除視網(wǎng)膜病變、心血管疾病、腎病、神經(jīng)病變等疾病外，還會(huì)導(dǎo)致骨丟失和骨質(zhì)疏松，影響骨愈合，增加骨折的風(fēng)險(xiǎn)。隨著糖尿病患者數(shù)量增加，糖尿病導(dǎo)致的骨代謝疾病成為全球重要的疾病負(fù)擔(dān)[2-4]。有證據(jù)表明，糖尿病微環(huán)境可影響糖尿病骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs)而導(dǎo)致機(jī)體骨代謝失衡，但其具體機(jī)制尚不清楚[5-6]。

微RNA (microRNA，miRNA) 是一類短的非編碼RNA，通過靶向靶基因調(diào)控蛋白表達(dá)參與細(xì)胞增殖、凋亡、遷移等多種生物學(xué)過程，與骨代謝和骨穩(wěn)態(tài)密切相關(guān)[7]。miR-145-5p 靶向SOX9 抑制正常人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞增殖及成軟骨分化[8]；靶向Smad4 可降低Sox-9、Col-2A1、聚集蛋白聚糖的表達(dá)，抑制骨關(guān)節(jié)炎患者源骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和成軟骨分化[9]。miR-145-5p 還可靶向SEMA3A 降低Wnt 通路基因Wnt3a、Wnt10a 的表達(dá)，抑制2 型糖尿病大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化[10]。然而，miR-145-5p 對(duì)2 型糖尿病股骨BMMSCs 成骨分化的影響尚不清楚。本研究比較正常大鼠與2 型糖尿病大鼠股骨BMMSCs 的增殖和成骨分化能力，初步探討正常大鼠與2 型糖尿病大鼠股骨BMMSCs 成骨分化中miR-145-5p、SEMA3A、β-catenin 表達(dá)的差異，為進(jìn)一步研究miRNA-145-5p 在糖尿病環(huán)境下影響骨代謝的分子機(jī)制提供依據(jù)。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8 周齡SPF 級(jí)雄性Wistar 大鼠(共12 只) 購于維通利華有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2021-0011。8 周齡雄性GK 大鼠(共12只)購于常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(蘇)2016-0010。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)解放軍總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核并予以批準(zhǔn)(2021-X17-90)。

2 主要試劑和儀器 羅氏Accu-Check Active 活力型血糖儀(Roche，瑞士)，低糖DMEM (Gibco，美國)，胎牛血清(Gibco，美國)，CCK-8 試劑盒(日本同仁，日本)，結(jié)晶紫染色液(碧云天，中國)，抗壞血酸(Sigma，美國)，β-甘油磷酸鈉(Sigma，美國)，地塞米松(Sigma，美國)，茜素紅S 染色液(Sigma，美國)，OriCell?間充質(zhì)干細(xì)胞(大鼠)表面標(biāo)記檢測(cè)試劑盒(Cyagen, 中國)，堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP) 染色液(偶氮偶聯(lián)法) (Solarbio，中國)，ALP 檢測(cè)試劑盒(碧云天，中國)，Western blot 及IP 細(xì)胞裂解液(無抑制劑) (碧云天，中國)，BCA 蛋白定量試劑盒(Solarbio，中國)，RNA 提取液(Servicebio，中國)，ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒(Servicebio，中國)，熒光定量PCR 儀(Bio-Rad，美國)。

3 2 型糖尿病大鼠模型建立 高脂高糖飼料喂養(yǎng)GK 大鼠(12 只) 構(gòu)建2 型糖尿病大鼠模型，作為實(shí)驗(yàn)組；普通飼料喂養(yǎng)Wistar 大鼠(共12 只)作為對(duì)照組。8 ~ 13 周每周于固定時(shí)間測(cè)定體質(zhì)量、大鼠尾靜脈采血進(jìn)行隨機(jī)血糖檢測(cè)。2 次隨機(jī)血糖濃度≥16.7 mmol/L 視為2 型糖尿病模型造模成功[11]。

4 股骨BMMSCs 原代培養(yǎng)及傳代 取正常Wistar大鼠和造模成功的GK 大鼠各12 只，腹腔注射過量戊巴比妥鈉處死，分離出雙側(cè)股骨，用咬骨鉗去除股骨兩端，暴露骨髓腔，用5 mL 注射器吸取普通培養(yǎng)液(含10% 胎牛血清和1% 青鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)液)沖洗骨髓腔，收集沖洗液于100 mm大皿中，細(xì)胞孵育箱內(nèi)培養(yǎng)(37 ℃，5% CO2)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)80%融合時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，使用第3 代Wistar 大鼠BMMSCs (WT-BMMSCs)和GK 大鼠BMMSCs (GK-BMMSCs)進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)[12]。

5 干細(xì)胞表型檢測(cè) 取第3 代WT-BMMSCs 和GK-BMMSCs，PBS 洗2 次，0.25% 胰蛋白酶消化，1000 r/min 離心5 min，棄去上清液。各管加入流式細(xì)胞緩沖液重懸細(xì)胞，使細(xì)胞濃度為3 ×106/mL。取100 μL 細(xì)胞懸液放入1.5 mL EP 管，每管加入2 μL 一抗CD90、CD44、CD34、CD45、CD11b/c 混勻。4℃孵育30 min，用200 μL 流式緩沖液清洗細(xì)胞2 次。250 g 離心5 min，棄上清。每管加入100 μL 流式細(xì)胞緩沖液，加入二抗，重懸細(xì)胞。4℃孵育30 min，用200 μL 流式緩沖液清洗細(xì)胞2 次。250 g 離心5 min，棄上清。用300 μL 流式細(xì)胞緩沖液重懸細(xì)胞后流式細(xì)胞儀分析。

6 CCK-8 檢測(cè)細(xì)胞生長 取第3 代WT-BMMSCs和GK-BMMSCs， 以2 × 103/孔的密度接種于96孔板(普通培養(yǎng)液)，每組樣本量為6。培養(yǎng)的1 ~9 d，每孔加入10 μL CCK-8 工作液，37℃孵箱孵育2 h 后，于450 nm 處檢測(cè)兩組細(xì)胞的吸光度值，連續(xù)檢測(cè)9 d，繪制細(xì)胞生長曲線。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

7 細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn) 取第3 代WT-BMMSCs和GK-BMMSCs，胰酶消化后重懸并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。以1 × 102/孔的密度接種于六孔板(普通培養(yǎng)液)，每組樣本量為6。常規(guī)培養(yǎng)10 d，棄去原培養(yǎng)液，4% 多聚甲醛固定30 min，結(jié)晶紫染色5 min，PBS 清洗3 遍，拍照。計(jì)數(shù)每孔的集落數(shù)，計(jì)算集落形成率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

8 成骨誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)分為WT-BMMSCs、GKBMMSCs、WT-BMMSCs + 成骨誘導(dǎo)液(osteogenic differentiation medium，OM)和GK-BMMSCs + OM四組。以2 × 105/孔的密度接種于六孔板(普通培養(yǎng)液)，每組樣本量為6。常規(guī)培養(yǎng)至細(xì)胞達(dá)70%融合后分別更換為普通培養(yǎng)液和成骨誘導(dǎo)液(含10%胎牛血清、1% 青鏈霉素、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、50 μg/mL 抗壞血酸和1 × 10-4mmol /L 地塞米松液的DMEM 培養(yǎng)液) 繼續(xù)培養(yǎng)。每3 d 換液1 次。

9 ALP 染色及半定量分析 成骨誘導(dǎo)7 d 后棄去誘導(dǎo)液，PBS 洗滌3 次，4% 多聚甲醛固定30 min，配置BCIP/NBT 染色工作液，每孔加入1 mL，室溫避光孵育15 min，PBS 洗滌2 次后拍照。半定量分析：棄去原培養(yǎng)液，PBS 清洗2 次，每孔加入100 μL 細(xì)胞裂解液充分裂解細(xì)胞，收集裂解液于EP 管中，4℃下12000 r/min離心30 min，取上清。BCA 法測(cè)定蛋白濃度，將樣品稀釋為50 μg/50 μL。每孔吸取50 μL 加入96 孔板中，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組和標(biāo)準(zhǔn)品組，每組設(shè)5 個(gè)復(fù)孔。加入50 μL 顯色液，37℃孵育10 min，每孔加入100 μL 終止液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀于405 nm 處測(cè)定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算ALP 表達(dá)量[13]。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

10 茜素紅染色觀察鈣化結(jié)節(jié) 成骨誘導(dǎo)21 d后，PBS 清洗1 次，4% 多聚甲醛固定30 min，1%茜素紅染色液染色5 min，PBS 清洗后拍照。

11 實(shí) 時(shí) 定 量PCR 檢 測(cè)miR-145-5p、SEMA3A、成骨相關(guān)基因和成骨通路關(guān)鍵蛋白的mRNA表達(dá) 實(shí)驗(yàn)分為WT-BMMSCs、GK-BMMSCs、WT-BMMSCs + OM 和 GK-BMMSCs + OM 四組，將細(xì)胞以2 × 105/孔的密度接種于六孔板中培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液，每組樣本量為3，待細(xì)胞達(dá)70%融合后分別更換為普通培養(yǎng)液和成骨誘導(dǎo)液繼續(xù)培養(yǎng)7 d。每孔加入1 mL Trizol，提取細(xì)胞總RNA，使用超微量分光光度計(jì)測(cè)定RNA 濃度及純度。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 共20 μL 反應(yīng)體系：5 ×Reaction Buffer 4 μL；Gene-specific primer 2 μL；Servicebio?RT Enzyme Mix 1 μL； RNA 10 μL；RNase free water 3 μL，程 序 設(shè) 置 為25℃變 性5 min；42℃退火30 min；85℃延伸5 s。然后配置以下反應(yīng)體系：2 × qPCR Mix 7.5 μL；基因引物(上游 + 下游) 1.5 μL；cDNA 2 μL；Water Nuclease-Free 4 μL，按 照 以 下 條 件 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性15 s；60℃延伸30 s，進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)，熒光定量PCR 檢測(cè)各組細(xì)胞中miR-145-5p、SEMA3A，成骨相關(guān)基因COL-1、RUNX2、ALP、OCN 和成骨通路關(guān)鍵蛋白β-catenin 的mRNA 表達(dá)水平。引物信息見表1。ΔΔCT 法處理結(jié)果，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值。

表1 引物序列Tab. 1 Primer sequences

12 Western blot 檢 測(cè)SEMA3A 和 成 骨 相 關(guān) 基因的蛋白表達(dá) 實(shí)驗(yàn)分為WT-BMMSCs、GKBMMSCs、WT-BMMSCs + OM 和GK-BMMSCs +OM 四組，將細(xì)胞以2 × 105/孔的密度接種于六孔板中培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液，每組樣本量為3，待細(xì)胞達(dá)70%融合后分別更換為普通培養(yǎng)液和成骨誘導(dǎo)液繼續(xù)培養(yǎng)7 d。培養(yǎng)結(jié)束后用PBS 清洗2 遍，每孔加入RIPA 裂解液200 μL，冰上裂解5 min，4℃下12000 r/min 離心10 min，收集上清，即為總蛋白溶液。BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。制備5% SDS-PAGE 凝膠電泳進(jìn)行蛋白分離，PVDF 轉(zhuǎn)膜，室溫下5% 脫脂牛奶封閉30 min，加入一抗(一抗稀釋比：Actin 1∶2000；ALP 1∶300； OCN 1∶300； RUNX2 1∶300；SEMA3A 1∶300) 4℃孵 育 過 夜；次 日TBST 洗3 次，每次5 min，加入二抗(二抗稀釋比 1∶500)室溫孵育30 min 后，TBST 洗3 次，ECL 發(fā)光液顯影檢測(cè)。使用Adobe 軟件對(duì)Western blot 條帶進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

13 統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 分 析 統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 分 析 使 用Graphpad Prism 8 軟件進(jìn)行，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，Tukey 多重比較檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 2 型糖尿病大鼠造模成功 通過4 周高脂高糖飼料的喂養(yǎng)，GK 大鼠出現(xiàn)血糖上升及多飲、多食、多尿現(xiàn)象。12 周時(shí)GK 大鼠的體質(zhì)量顯著低于Wistar 大鼠(P＜0.001；圖1)，同時(shí)血糖顯著高于Wistar 大鼠并維持穩(wěn)定(P＜0.001；圖2)。連續(xù)兩次檢測(cè)隨機(jī)血糖≥16.7 mmol/L，GK 大鼠2 型糖尿病模型造模成功。

圖1 8 ~ 13 周Wistar 與GK 大鼠體質(zhì)量(n=12；aP＜0.001，vsGK)Fig.1 Changes in body weight of Wistar and GK rats from 8 to 13weeks (n=12; aP＜0.001, vsGK)

圖2 8 ~ 13 周Wistar 與GK 大鼠血糖(n=12；aP＜0.001，vsGK)Fig.2 Changes in blood glucose of Wistar and GK rats feom 8 to 13weeks (n=12; aP＜0.001, vsGK)

2 股骨BMMSCs 分離培養(yǎng)及干細(xì)胞表型檢測(cè)鏡下見原代細(xì)胞呈長梭形或多角形，貼壁生長，夾雜著圓形高亮未貼壁的雜細(xì)胞，原代細(xì)胞培養(yǎng)6 ~ 8 d 可達(dá)融合，傳代后細(xì)胞2 ~ 4 d 可達(dá)融合(圖3)。流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行干細(xì)胞表型檢測(cè)，結(jié)果顯示，體外培養(yǎng)的WT-BMMSCs 和GK-BMMSCs均陽性表達(dá)大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD90(97.5%/99.6%) 、CD44 (98.8%/97.9%)，陰性表達(dá)造血 干細(xì) 胞 標(biāo) 志 物CD34 (1.49%/2.47%)、CD45(1.13%/1.55%)、CD11b/c (1.51%/1.87%)。符 合 干細(xì)胞分子表型(圖4)。

圖3 倒置顯微鏡觀察原代(P0)與第3 代(P3)正常和糖尿病大鼠BMMSCs (標(biāo)尺=100 μm)Fig.3 Primary and the third generation BMMSCs derived fromnormal and type 2 diabetic rats (scale bar=100 μm)

圖4 流式細(xì)胞學(xué)鑒定BMMSCs 表面抗原F ig.4 Identification of BMMSCs surface antigens by flow cytometry

3 WT-BMMSCs 和GK-BMMSCs 的生物學(xué)特性比較

3.1 細(xì)胞生長曲線 CCK-8 結(jié)果顯示，兩組細(xì)胞的生長曲線均呈現(xiàn)出生長潛伏期、對(duì)數(shù)生長期和平臺(tái)期，從4 d 開始，WT-BMMSCs 的增殖速率顯著高于GK-BMMSCs (P＜0.01；圖5)。

圖5 CCK-8 試劑盒檢測(cè)正常和糖尿病大鼠股骨BMMSCs 生長曲線(n=6；aP＜0.01，vsGK)Fig.5 Detection of growth curve of BMMSCs derived from normaland type 2 diabetic rats by CCK-8 kit (n=6; aP＜0.01, vsGK)

3.2 集落形成能力 結(jié)晶紫染色結(jié)果顯示，WTBMMSCs 和GK-BMMSCs 培養(yǎng)10 d 時(shí)均有細(xì)胞集落形成，WT-BMMSCs 集落形成率顯著高于GKBMMSCs (P＜0.01；圖6)。

圖6 正常和糖尿病大鼠股骨BMMSCs 集落形成實(shí)驗(yàn)A：結(jié)晶紫染色檢測(cè)正常和糖尿病大鼠10 d 時(shí)股骨BMMSCs 集落形成能力(標(biāo)尺=100 μm)；B：正常和糖尿病大鼠股骨BMMSCs 集落形成率(n=6)Fig.6 Colony formation experiment of femoral BMMSCs in normal rats and type 2 diabetic rats A: Crystal violet staining were performed on day 10 (scale bar=100 μm); B: Colony forming efficiency of the two group (n=6)

3.3 成骨分化能力 成骨誘導(dǎo)7 d 后ALP 染色結(jié)果表明，WT-BMMSCs 染色較GK-BMMSCs 深，ALP 半定量檢測(cè)結(jié)果與染色結(jié)果一致(P＜0.001；圖7A、圖7B)。成骨誘導(dǎo)21 d 后茜素紅染色結(jié)果顯示，正常組和GK-BMMSCs 均出現(xiàn)大小不等的鈣化結(jié)節(jié)，WT-BMMSCs 染色較GK-BMMSCs深(圖7C)。

圖7 正常與2 型糖尿病大鼠BMMSCs 成骨分化能力比較A：成骨誘導(dǎo)7 d 堿性磷酸酶染色(標(biāo)尺=100 μm)；B：成骨誘導(dǎo)7 d ALP 半定量分析 (n=6)；C：成骨誘導(dǎo)21 d 茜素紅染色顯示鈣化結(jié)節(jié)形成(標(biāo)尺=100 μm)Fig.7 Comparison of osteogenic differentiation capacity of BMMSCs derived from normal rats and type 2 diabetic rats A: ALP staining was performed on day 7 after osteogenic differentiation (scale bar=100μm); B: Quantification of ALP activity was shown (n=6); C: ARS staining was performed on day 21 after osteogenic differentiation to show the formation of calcified nodules(scale bar=100μm)

4 WT-BMMSCs 和GK-BMMSCs 成骨分化相關(guān)基因的表達(dá) qRT-PCR 結(jié)果顯示，成骨誘導(dǎo)7 d時(shí)WT-BMMSCs 和GK-BMMSCs 成骨誘導(dǎo)組成骨分化相關(guān)基因ALP、OCN、RUNX2、COL1 的表達(dá)均顯著高于未誘導(dǎo)組(P＜0.05)，而GK-BMMSCs成骨誘導(dǎo)組的表達(dá)顯著低于WT-BMMSCs 成骨誘導(dǎo)組(P＜0.01；圖8)。Western blot 結(jié)果顯示，WTBMMSCs 誘導(dǎo)組成骨基因ALP、OCN 表達(dá)均顯著高于未誘導(dǎo)組，GK-BMMSCs 成骨誘導(dǎo)組的表達(dá)顯著低于WT-BMMSCs 成骨誘導(dǎo)組(P＜0.001)，而GK-BMMSCs 成骨誘導(dǎo)組的表達(dá)與未誘導(dǎo)組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。WT-BMMSCs 和GK-BMMSCs 成骨誘導(dǎo)組成骨基因RUNX2 表達(dá)均顯著高于未誘導(dǎo)組，而GK-BMMSCs 成骨誘導(dǎo)組的表達(dá)顯著高于WT-BMMSCs 成骨誘導(dǎo)組(P＜0.001；圖9)。

圖8 成骨誘導(dǎo)7 d 正常與2 型糖尿病大鼠BMMSCs ALP、OCN 、RUNX2、COL1 的mRNA 表達(dá)(n=3)Fig.8 Expression level of the osteoblast differentiation-related genes ALP, OCN, RUNX2, COL1 on day 7 after osteogenic differentiation by real-time PCR (n=3)

圖9 成骨誘導(dǎo)7 d 正常與2 型糖尿病大鼠BMMSCs ALP、OCN、RUNX2 蛋白水平的表達(dá)A： ALP、OCN、RUNX2 蛋白的表達(dá)； B：ALP、OCN 、RUNX2 蛋白水平表達(dá)的定量分析(n=3)Fig.9 Western blot analysis of ALP, OCN, RUNX2 on day 7 after osteogenic differentiation A：Western blotting of ALP, OCN, RUNX2；B：Protein levels of ALP, OCN, RUNX2 quantified by densitometry (n=3)

5 WT-BMMSCs 和GK-BMMSCs成骨分化中miR-145-5p、SEMA3A 及β-catenin 的表達(dá) qRT-PCR 結(jié)果顯示，成骨誘導(dǎo)7 d 時(shí)WT-BMMSCs miR-145-5p表達(dá)顯著低于未誘導(dǎo)組(P＜0.05)，GK-BMMSCs成骨誘導(dǎo)組的表達(dá)相反且顯著高于WT-BMMSCs成骨誘 導(dǎo) 組(P＜0.001)。WT-BMMSCs 和GKBMMSCs 成骨誘導(dǎo)組SEMA3A 的表達(dá)均顯著低于未誘導(dǎo)組(P＜0.001)，GK-BMMSCs 成骨誘導(dǎo)組的表達(dá)顯著低于WT-BMMSCs 成骨誘導(dǎo)組(P＜0.05)。WT-BMMSCs 和GK-BMMSCs 成骨誘導(dǎo)組成骨通路關(guān)鍵蛋白β-catenin 的表達(dá)均顯著高于未誘導(dǎo)組(P＜0.01)，GK-BMMSCs 成骨誘導(dǎo)組的表達(dá)顯著低于WT-BMMSCs 成骨誘導(dǎo)組(P＜0.01；圖10)。Western blot 結(jié)果顯示，WT-BMMSCs 和GK-BMMSCs 誘導(dǎo)組SEMA3A 表達(dá)均顯著高于未誘導(dǎo)組，GK-BMMSCs 誘導(dǎo)組的表達(dá)與WTBMMSCs 誘導(dǎo)組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05；圖11)。

圖10 成骨誘導(dǎo)7 d 正常與2 型糖尿病大鼠BMMSCs miR-145-5p、SEMA3A、β-catenin 的表達(dá)(n=3)Fig.10 Expression levels of miR-145-5p, SEMA3A, β-catenin on day 7 after osteogenic differentiation by real-time PCR (n=3)

圖11 成骨誘導(dǎo)7 d 正常與2 型糖尿病大鼠BMMSCs SEMA3A 的蛋白表達(dá)A：SEMA3A 蛋白的表達(dá)；B：SEMA3A 蛋白水平表達(dá)的定量分析(n=3)Fig.11 Western blot analysis of SEMA3A on day 7 after osteogenic differentiation A: Western blotting of SEMA3A; B: Protein levels of SEMA3A quantified by densitometry (n=3)

討 論

糖尿病作為一種常見代謝性疾病，其引起的骨質(zhì)疏松等疾病嚴(yán)重危害人類健康[14]。BMMSCs是理想的骨再生醫(yī)學(xué)種子細(xì)胞，具有自我更新和多向分化潛能，其成骨分化功能降低是骨質(zhì)疏松癥發(fā)病的重要機(jī)制[13]。以往研究表明，糖尿病高糖微環(huán)境會(huì)導(dǎo)致BMMSCs 成骨分化能力降低從，而導(dǎo)致骨密度降低和骨再生障礙，其具體機(jī)制尚不十分清楚[5-6]。研究顯示，miRNAs 在干細(xì)胞成骨分化中具有重要的作用。因此，本研究探討了正常大鼠與2 型糖尿病大鼠BMMSCs 成骨分化能力及在成骨分化中miR-145-5p、SEMA3A、β-catenin表達(dá)的差異。

GK 大鼠是非肥胖自發(fā)Ⅱ型糖尿病大鼠模型，表現(xiàn)出與人類糖尿病相似的代謝、內(nèi)分泌、血管疾病和糖尿病并發(fā)癥。高血糖和胰島素抵抗是T2DM 的主要癥狀。本研究中高脂高糖飼料喂養(yǎng)后GK 大鼠的高血糖符合T2DM 的特點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)成功建立了穩(wěn)定的2 型糖尿病大鼠模型[15]。我們培養(yǎng)的正常大鼠和2 型糖尿病大鼠BMMSCs 陽性表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物，陰性表達(dá)造血干細(xì)胞表面標(biāo)志物并能向成骨分化，符合干細(xì)胞特性[16]。2 型糖尿病大鼠BMMSCs 的增殖能力、細(xì)胞集落形成能力和成骨分化能力降低，這與以往研究結(jié)果一致[5,17]，提示2 型糖尿病導(dǎo)致股骨BMMSCs 的功能障礙。有研究證實(shí)，干細(xì)胞在成骨分化過程中經(jīng)歷增殖期、分化期、礦化期和凋亡期四個(gè)階段，而后形成骨細(xì)胞，在增殖期(1 ~7 d)，增殖相關(guān)基因、COL1 和成骨分化相關(guān)基因RUNX2、OPN 高表達(dá)，ALP、OCN 低表達(dá)；在分化期(7 ~ 14 d)，增殖相關(guān)基因、COL1 和成骨分化相關(guān)基因RUNX2、OPN 表達(dá)下降，ALP、OCN表達(dá)升高[18]。值得注意的是，在本研究中，培養(yǎng)7 d 時(shí)，2 型糖尿病大鼠BMMSCs 的增殖能力、細(xì)胞集落形成能力和成骨分化相關(guān)標(biāo)志物ALP、OCN 的蛋白表達(dá)水平低于正常大鼠BMMSCs，而RUNX2 蛋白表達(dá)水平卻高于正常大鼠BMMSCs。這些結(jié)果提示2 型糖尿病大鼠BMMSCs 從增殖期向分化期轉(zhuǎn)變晚于正常大鼠BMMSCs。

研究表明，miR-145-5p 抑制細(xì)胞成骨成軟骨分化。Zhu 等[8]報(bào)道m(xù)iR-145-5p 靶向SOX9 抑制正常人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞COL2、聚集蛋白聚糖的表達(dá)。Yu 等[19]報(bào)道m(xù)iR-145-5p 抑制TLR4 信號(hào)通路降低正常人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化能力。Liu 等[10]報(bào)道m(xù)iR-145-5p 靶向SEMA3A 降低Wnt通路基因 Wnt3a、Wnt10a 的表達(dá)，抑制2 型糖尿病大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化相關(guān)基因ALP、RUNX2、COL1 的表達(dá)。我們的研究發(fā)現(xiàn)，在正常大鼠BMMSCs 成骨分化中，成骨分化相關(guān)標(biāo)志物ALP、OCN、COL1、RUNX2 表達(dá)升高，miR-145-5p 表達(dá)降低，SEMA3A 和β-catenin 表達(dá)升高，這些結(jié)果與以上研究一致。提示miR-145-5p 可能通過靶向SEMA3A 調(diào)控β-catenin 來抑制正常大鼠BMMSCs 成骨分化。而在2 型糖尿病大鼠BMMSCs 成骨分化中，miR-145-5p、SEMA3A和β-catenin 表達(dá)均升高；miR-145-5p 和SEMA3A不是負(fù)向調(diào)控，可見miR-145-5p 在糖尿病源MSCs 成骨分化中有多種調(diào)控途徑，其具體的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)仍存在爭議，我們后續(xù)研究將進(jìn)一步探討。另有研究者報(bào)道在骨關(guān)節(jié)炎患者的軟骨組織中，miR-145-5p 的表達(dá)顯著高于非骨關(guān)節(jié)炎患者，miR-145-5p 靶向Smad4 降低 Sox-9、Col-2a1、聚集蛋白聚糖的表達(dá)，抑制骨關(guān)節(jié)炎患者源骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和成軟骨分化[9]。在我們的研究中，經(jīng)成骨誘導(dǎo)后，2 型糖尿病大鼠BMMSCs miR-145-5p 的表達(dá)顯著高于正常BMMSCs，SEMA3A和β-catenin 表達(dá)顯著低于正常BMMSCs。這些結(jié)果提示miR-45-5p 在2 型糖尿病大鼠BMMSCs 成骨分化關(guān)鍵途徑中也發(fā)揮重要的抑制作用。

綜上所述，本研究結(jié)果提示，2 型糖尿病大鼠BMMSCs 細(xì)胞增殖、集落形成及成骨分化能力降低，我們推測(cè)正常大鼠BMMSCs 成骨分化中miR-145-5p 起抑制作用，2 型糖尿病大鼠BMMSCs 成骨分化中miR-145-5p 起促進(jìn)作用，miR-145-5p 是否靶向SEMA3A 通過Wnt/β-catenin 調(diào)控成骨仍需要進(jìn)一步研究。miR-145-5p 或許可作為治療糖尿病引起的骨代謝疾病的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

作者貢獻(xiàn)戴雅文：細(xì)胞及分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，文章撰寫；鄂玲玲：課題設(shè)計(jì)，課題指導(dǎo)；鄭穎、馬小草：文章修改，文章審閱，文章校正；張戎：文獻(xiàn)收集和整理；時(shí)權(quán)：統(tǒng)計(jì)分析；劉洪臣：寫作指導(dǎo)，修訂，終審論文。

利益沖突所有作者聲明無利益沖突。

數(shù)據(jù)共享聲明本篇論文相關(guān)數(shù)據(jù)可依據(jù)合理理由從作者處獲取，Email：395298305@qq.com。