骨橋蛋白通過PI3K/AKT/mTOR 信號通路調(diào)控低氧誘導的肺動脈平滑肌細胞自噬和增殖的機制探討

丁 琦，劉川川，王 澤，周 銳，劉輝琦，陳辛玲，王生蘭青海大學醫(yī)學部，青海 西寧 8000；青海大學附屬醫(yī)院包蟲病實驗室，青海 西寧 8000；中國人民武裝警察部隊河北省總隊醫(yī)院，河北 石家莊 0500；重慶市開州區(qū)人民醫(yī)院，重慶 0599

低氧性肺動脈高壓(hypoxic pulmonary hypertension，HPH)是指因低氧導致肺動脈平滑肌細胞(pulmonary arterial smooth muscle cells，PASMCs)過度增殖從而引起血管重構(gòu)，進而使其壓力升高，最終發(fā)展為右心衰竭的病理生理學過程[1-2]。骨橋蛋白(osteopontin，OPN)在血管重構(gòu)中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[3]。OPN 是由Spp1 編碼的一種具有多種生理功能的整合素結(jié)合蛋白，廣泛表達于骨細胞、神經(jīng)細胞、上皮細胞、內(nèi)皮細胞、血管平滑肌細胞等各種細胞[4]。其生理功能與細胞增殖、自噬、黏附、遷移和血管生成等密切相關[5]。研究發(fā)現(xiàn)，OPN 可使PASMCs 由收縮表型轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣杀硇停筆ASMCs 增殖，引起血管重塑，導致肺動脈壓力升高[6]。但在低氧條件下OPN 調(diào)控PASMCs自噬在低氧性肺動脈高壓形成中的作用機制尚未不明確。因此，本研究以OPN 通過PI3K/AKT/mTOR 信號通路調(diào)控細胞自噬為切入點，探討OPN 在低氧條件刺激下對PASMCs 自噬、增殖的影響及其機制。

材料與方法

1 動物、主要材料及儀器 6 周SPF 級雄性SD大鼠10 只(130 ~ 150 g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，合格證號：110322220100347 884)。Ⅱ型膠原酶(C8150) 購于北京索萊寶公司；DMEM 培養(yǎng)基(PM150210)購于武漢Procell 公司；免疫組化試劑盒(E-IR-R215)購于Elabscience 公司；EdU-488 細胞增殖檢測試劑盒(C0071S)、EdU-555細胞增殖檢測試劑盒(C0075S)購于上海碧云天公司；胎牛血清(10099-141C)購于美國Gibco 公司；BCA 蛋白定量試劑盒(23227) 購于Thermo Fisher Scientific 公司；OPN shRNA 干擾慢病毒(VPSLV22 0223CHH1)由賽業(yè)生物科技有限公司合成并包裝；β-actin 內(nèi)參抗體(AC026)購于武漢Abclonal 公司；OPN(ab63856)、PI3K(ab191606)、Beclin1(ab207612)、LC3B(ab192890)購于Abcam 公司。超凈工作臺(京東聯(lián)哈爾公司，DL-CJ-1NDII)；CO2細胞培養(yǎng)箱(美國ThermoFisher 公司，Thermo HERAcell 150i)；三氣培養(yǎng)箱(德國BINDER 公司，CB53)；蛋白電泳儀(美國Bio-Rad 公司，1645050)，臺式離心機(德國Sigma 公司，3K15)；倒置熒光顯微鏡(德國蔡司Zeiss 公司，Ax10 Axio)。

2 原代PASMCs 分離培養(yǎng) 大鼠經(jīng)2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后頸椎脫臼安樂死，置于75%乙醇中消毒3 min。在超凈工作臺中打開胸腔取出心肺組織，置于盛有4℃預冷無菌PBS 的培養(yǎng)皿中。去除心臟并用PBS 清洗肺組織，將肺組織固定于含浮漂培養(yǎng)皿中。沿肺動脈主干向下逐級分離出二、三級肺動脈。將其轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)皿中，清洗后縱向剪開肺小動脈，用手術(shù)刀輕輕刮除內(nèi)皮細胞，用眼科鑷分離外膜和中膜。將中層平滑肌組織剪成1 mm3大小的組織塊，隨后將組織塊轉(zhuǎn)移至含有1 ~ 2 mL 0.2% Ⅱ型膠原酶的15 mL離心管中，將離心管置于37℃水浴鍋消化1 h 左右，觀察組織塊變?yōu)樾鯛顣r即可結(jié)束消化。消化結(jié)束后細胞用含有20% FBS 和1% PS 的DMEM培養(yǎng)基重懸，置于37℃、5% CO2濕潤培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞生長至培養(yǎng)瓶70%左右時，用差速貼壁法純化細胞。免疫細胞化學法進行鑒定，第3 ~5 代細胞用于后續(xù)實驗研究。

3 免疫細胞化學法鑒定PASMCs 對數(shù)生長期PASMCs 用0.2% 的胰蛋白酶消化，將1 × 104個細胞接種于6 孔細胞培養(yǎng)板。細胞貼壁后，棄去原有培養(yǎng)基，用PBS 洗滌兩次，加入4%多聚甲醛室溫固定細胞15min。后續(xù)按二步法免疫組化試劑盒步驟操作。用蘇木素復染細胞核，在熒光顯微鏡下觀察拍照。

4 細胞慢病毒轉(zhuǎn)染和分組 對數(shù)生長期PASMCs接種于25 mm2培養(yǎng)瓶中，待細胞長至30% ~ 40%時進行細胞轉(zhuǎn)染(干擾序列見表1)。常氧對照組(Normoxia)加DMEM 基礎培養(yǎng)基；低氧對照組(Hypoxia)加DMEM 基礎培養(yǎng)基；低氧 + OPN 干擾空病毒組(H + OPN EV)加OPN 空病毒；低氧 +OPN 干擾慢病毒組(H + OPN shRNA)加OPN 干擾慢病毒；低氧 + PI3K 抑制劑LY294002 組(H +LY)加含PI3K 抑制劑LY294002 的基礎培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染12 h 后在熒光顯微鏡下觀察，轉(zhuǎn)染成功后更換培養(yǎng)液，將細胞置于低氧培養(yǎng)箱( 37℃，5%CO2，1% O2)中培養(yǎng)48 h。收集各組細胞用于后續(xù)實驗。

表1 干擾序列Tab. 1 Interference sequence

5 Western blot 檢測LC3B、Beclin1、OPN、PI3K、AKT、mTOR 蛋白表達 收集各組細胞，加入適量RIPA 裂解液在冰上裂解后收集上清。用BCA法檢測蛋白濃度。以每孔30 μg 蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，將目的蛋白轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。將膜與LC3B(1:1000)、Beclin1(1:1000)、OPN(1:1000)、PI3K(1:1000)、AKT(1:1000)、mTOR(1:1000)、βactin(1:1500)抗體4℃冰箱孵育過夜。次日TBST洗膜3 次后加入二抗室溫孵育1 h。洗滌后用ECL超敏發(fā)光液在凝膠成像儀中顯影并保存圖像，用Image J 軟件分析條帶灰度值，以β-actin 為內(nèi)參計算蛋白相對表達量。

6 細胞免疫熒光染色 對數(shù)生長期PASMCs 接種于激光共聚焦專用培養(yǎng)皿，待細胞貼壁后根據(jù)分組進行干預。收集5 組細胞，PBS 洗滌后加入4%多聚甲醛室溫固定15 min。PBS 洗去多聚甲醛后，加入0.25% Triton X-100 通透液室溫通透30 min。隨后滴加3% BSA 封閉室溫封閉30 min。棄去封閉液，加入Beclin1(1:200)、LC3B(1:200)一抗4℃孵育過夜。次日，細胞經(jīng)PBS 洗滌后加入Cy3 標記山羊抗兔二抗(1:200) 室溫避光孵育1 h。PBS 洗滌后滴加DAPI 避光染細胞核5 min。PBS 洗去多余的DAPI，在激光共聚焦顯微鏡下觀察并采集圖像。

7 透射電鏡 收集5 組細胞，加入3%戊二醛固定液于4℃固定24 h，加入1%四氧化鋨再固定2 h。將固定好的樣品浸入丙酮逐級脫水，脫水完成后用環(huán)氧樹脂包埋。將樣品制備成50 nm切片，切片用檸檬酸鉛染色后置于JEM-1400FLASH 透射電鏡下觀察并采集圖像。自噬體特征：雙層或多層膜濾泡狀結(jié)構(gòu)，內(nèi)含細胞質(zhì)成分。

8 EdU 檢 測 細胞增 殖 將對 數(shù) 生長期PASMCs用0.2% 胰蛋白酶消化，將4 × 103個細胞接種于24 孔細胞培養(yǎng)板，待細胞貼壁后進行相應干預處理，每組設置3 個復孔。培養(yǎng)48 h 后，每孔加入200 μL 終濃度為10 μmol/L EdU 工作液，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h。隨后，用4%多聚甲醛室溫固定細胞15min，后續(xù)按EdU 細胞增殖檢測試劑盒說明書操作。在熒光顯微鏡下觀察，每組隨機選擇5 個視野拍照。

9 統(tǒng)計學分析 實驗結(jié)果采用 Graph Pad Prism 8.0.2 軟件進行統(tǒng)計分析和圖形繪制。服從正態(tài)分布數(shù)據(jù)以xˉ±s表示，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 PASMCs 的免疫學鑒定 免疫細胞化學染色結(jié)果顯示，觀察到細胞呈典型的峰谷樣生長，99%的細胞均能表達α-SMA，表明培養(yǎng)的細胞為平滑肌細胞。見圖1。

圖1 α-SMA 免疫細胞化學染色鑒定Fig.1 α-SMA Immunocytochemical staining

2 干 擾OPN 表 達 后PASMCs 中OPN、Beclin1、LC3B、PI3K、AKT、mTOR 蛋白表達水平 Western blot 實驗結(jié)果表明，與Normoxia 組相比，低氧處理的PASMCs 中OPN、PI3K、AKT、mTOR 及自噬相關蛋白Beclin1、LC3B 的蛋白表達水平均升高(P＜0.05)；與Hypoxia 組相比，H + OPN EV組OPN、PI3K、AKT、mTOR 及自噬相關蛋白Beclin1、LC3B 的蛋白表達水平無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，H + OPN shRNA 組OPN、PI3K、AKT、mTOR 蛋白表達降低(P＜0.05)，自噬相關蛋白Beclin1、LC3B 表達增加(P＜0.05)。見圖2。

圖2 各組細胞PI3K、AKT、mTOR、OPN 及自噬相關蛋白表達量(x ˉ±s，n=4)aP＜0.05，vs常氧對照組；bP＜0.05，vs低氧對照組Fig.2 Expression levels of PI3K, AKT, mTOR, OPN and autophagy-related proteins in each group (x ˉ±s, n=4)aP＜0.05, vsNormoxia group; bP＜0.05, vsHypoxia group

3 使用PI3K 抑制劑后PASMCs 中OPN、Beclin1、LC3B、PI3K、AKT、mTOR 蛋白表達水平 Western blot 實驗結(jié)果表明，與Hypoxia 組相比，低氧下加入PI3K 抑制劑LY294002 后，OPN、PI3K、AKT、mTOR 表達降低(P＜0.05)，自噬相關蛋白Beclin1、LC3B 表達增加(P＜0.05)。見圖3。

圖3 各組細胞PI3K、AKT、mTOR、OPN 及自噬相關蛋白表達量(x ˉ±s，n=4)aP＜0.05，vs常氧對照組；bP＜0.05，vs低氧對照組Fig.3 Expression levels of PI3K, AKT, mTOR, OPN and autophagy-related proteins in each group (x ˉ±s, n=4)aP＜0.05, vsnormoxia；bP＜0.05, vshypoxia

4 細胞免疫熒光法觀察各組細胞自噬蛋白表達的情況 為進一步觀察各組細胞自噬相關蛋白變化情況，免疫熒光染色法檢測PASMCs 中LC3B、Beclin1 表達。結(jié)果顯示，5 組PASMCs 中LC3B、Beclin1 陽性均定位于細胞質(zhì)。與Normoxia 組相比，低氧處理的PASMCs 中LC3B、Beclin1 紅色熒光強度增強(P＜0.05)；與Hypoxia 相比，H +OPN EV 組LC3B、Beclin1 紅色熒光強度無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，H + OPN shRNA 組LC3B、Beclin1紅色熒光強度增強(P＜0.05)，H + LY 組LC3B、Beclin1 紅色熒光強度增強(P＜0.05)。見圖4、圖5。

圖4 細胞免疫熒光觀察各組PASMCs LC3B 表達情況aP＜0.05，vs常氧對照組；bP＜0.05，vs低氧對照組Fig.4 LC3B expression of PASMCs in each group was observed by immunofluorescenceaP ＜0.05, vsNormoxia group; bP ＜0.05, vsHypoxia group

圖5 細胞免疫熒光觀察各組PASMCs Beclin1 表達情況aP＜0.05，vs常氧對照組；bP＜0.05，vs低氧對照組Fig.5 Beclin1 expression of PASMCs in each group was observed by immunofluorescenceaP＜0.05, vsNormoxia group; bP＜0.05, vsHypoxia group

5 透射電鏡觀察各組細胞自噬小體形成情況 為更加直觀地觀察各組細胞自噬的變化情況，采用透射電鏡觀察各組細胞自噬小體形成情況。結(jié)果表明，Normoxia 組中存在少量自噬小體(↑)，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴張(↑)；Hypoxia 組中自噬小體數(shù)量較Normoxia 組增多(↑)，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張呈囊狀(↑)；H + OPN EV 組與Hypoxia 組中自噬小體數(shù)量無統(tǒng)計學差異，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴張(↑)；H +OPN shRNA 組細胞質(zhì)內(nèi)有大量自噬小體(↑)，線粒體輕度腫脹(↑)，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張呈囊狀(↑)；H +LY 組細胞質(zhì)內(nèi)有大量自噬小體(↑)，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張呈囊狀(↑)。見圖6。

圖6 電鏡觀察各組PASMCs 超微結(jié)構(gòu)變化(20000×)N：細胞核；Mi：線粒體；RER：粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；GB：高爾基體；Atg：自噬小體Fig.6 Ultrastructural changes of PASMCs in each group were observed by electron microscopy (20000×)N: nucleus; Mi: mitochondrion; RER: rough endoplasmic reticulum; GB: Golgi body; Atg: autophagosome

6 各組細胞增殖能力 為檢測各組PASMCs 增殖能力變化，使用EdU 細胞增殖檢測試劑盒檢測各組細胞增殖情況。結(jié)果顯示，與Normoxia 組相比，Hypoxia 組細胞增殖能力增強(P＜0.05)；與Hypoxia 組相比，H + OPN EV 組細胞增殖能力無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，H + OPN shRNA 組、H +LY 組細胞增殖能力均降低(P＜0.05)。見圖7。

圖7 EdU 檢測細胞增殖(xˉ±s，n=5)aP＜0.05，vs常氧對照組；bP＜0.05，vs低氧對照組Fig.7 Cell proliferation detected by EdU assay (x ˉ±s, n=5)aP＜0.05, vsNormoxia group; bP＜0.05, vsHypoxia group

討 論

HPH 是一種以肺血管收縮和血管重構(gòu)為主要特征的病理過程，其發(fā)病機制復雜，目前未完全闡明。研究發(fā)現(xiàn)其發(fā)病機制包括炎癥介質(zhì)因素、細胞因素(增殖、凋亡、自噬)、細胞外神經(jīng)體液因素(神經(jīng)遞質(zhì)、血管活性肽、細胞因子、生長因子等)、離子通道(鈣通道、鉀通道)和基因表達等[7-9]。

OPN 是一種多功能蛋白質(zhì)，具有免疫調(diào)節(jié)、參與細胞的增殖和轉(zhuǎn)移等作用[6]。OPN 經(jīng)細胞釋放后，其RGD 序列可與靶細胞表面整合素受體結(jié)合，從而激活細胞內(nèi)特異性信號傳導系統(tǒng)，介導細胞間的自噬、炎癥與免疫、增殖和凋亡，進而誘發(fā)各種疾病[3,10]。Wohlleben 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，低氧可以誘導結(jié)直腸癌細胞OPN 表達上調(diào)，放射抗性增加。Bellan 等[12]研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)締組織病引起肺動脈高壓患者的OPN 血漿值顯著高于單純結(jié)締組織病患者，OPN 可能作為肺動脈高壓的非侵入性疾病生物標志物發(fā)揮作用。Mura 等[13]研究表明，在重癥肺動脈高壓患者的肺組織中OPN 表達升高，并可促進PASMCs 增殖、增強血管重塑，且OPN 表達水平與疾病嚴重程度相關。這與本研究結(jié)果一致，低氧條件下PASMCs 內(nèi)OPN 表達增加，且OPN 可以促進低氧誘導的PASMCs 增殖。

自噬是指通過一系列途徑將細胞質(zhì)內(nèi)的某些物質(zhì)轉(zhuǎn)移至溶酶體中進而被降解的過程[14]。自噬體的形成由Ⅲ類磷酸肌醇3-激酶和自噬相關基因6(也稱為 Beclin1，BECN1) 啟動[15]。自噬過程中，LC3Ⅱ可參與自噬體形成并可與溶酶體融合，故作為自噬體的標記，且LC3Ⅱ的水平從某種程度上反映了自噬體的數(shù)量[16]。Beclin1、LC3Ⅱ的含量可作為監(jiān)測自噬活動的強度指標[15-16]。自噬與肺動脈高壓的機制研究發(fā)現(xiàn)，自噬激活的程度可能決定自噬是抑制因子還是啟動子，在不同的實驗條件下，自噬可能是肺動脈高壓發(fā)展的一把雙刃劍[16]。Yamanaka 等[17]研究發(fā)現(xiàn)，TP53 誘導的糖酵解和凋亡調(diào)節(jié)劑可以減弱PASMCs 自噬，能夠預防肺動脈高壓。Zhai 等[18]發(fā)現(xiàn)，激活磷酸腺苷活化蛋白激酶可以通過抑制NF-κB 介導的自噬來阻止野百合堿誘導的PAH。Liu 等[19]研究發(fā)現(xiàn)，與正常大鼠相比，低氧大鼠肺動脈中BECN-1 和LC3B-Ⅱ/Ⅰ比值顯著增加，且二甲雙胍可能通過抑制自噬來阻止低氧誘導的肺動脈高壓的發(fā)展。這些文獻報道表明，自噬可能參與了HPH 形成。這與本研究結(jié)果一致，在低氧誘導的PASMCs 內(nèi)自噬相關蛋白LC3B、Beclin1 表達升高。

細胞自噬的發(fā)生受多種基因和信號通路的調(diào)控。目前相關文獻顯示OPN 在不同的細胞中對自噬的調(diào)控有所不同，既可促進細胞自噬，也可抑制細胞自噬。 Sun 等[20]研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠模型中給予重組OPN 可以激活蛛網(wǎng)膜下腔出血后神經(jīng)元的自噬，此過程可能與FAK-ERK 信號通路有關。Lin 等[21]在研究心房纖維化中發(fā)現(xiàn)，OPN 可以通過激活AKT/GSK-3β/β-catenin 信號通路和抑制自噬，實現(xiàn)促纖維化作用。Tang 等[22]在研究非酒精性脂肪性肝病的發(fā)病過程中發(fā)現(xiàn)，OPN 可作為自噬的負調(diào)節(jié)因子，抑制自噬成熟，加速脂質(zhì)積累。本實驗在低氧條件下使用OPN 干擾慢病毒降低OPN 表達后，自噬相關指標表達升高，說明OPN 可以抑制低氧誘導的SD 大鼠PASMCs 自噬。

大量研究顯示，OPN 可能通過多種信號轉(zhuǎn)導通路調(diào)節(jié)細胞自噬。其中包括p38MAPK、PI3K/AKT/mTOR、CD44 等途徑[23-24]。其中最典型的是PI3K/AKT/mTOR 信號通路。PI3K/AKT/mTOR信號傳導通路的活化可誘導細胞生長、增殖、遷移，加快細胞周期，抑制細胞凋亡，調(diào)控細胞自噬，參與新生血管形成[24-26]。Peng 等[27]研究發(fā)現(xiàn)，NPS2390 可通過抑制下游PI3K/AKT/mTOR 信號通路，降低自噬蛋白和合成表型標記蛋白OPN的表達，提高收縮表型標記蛋白α-SMA 和鈣調(diào)蛋白的表達。Zhang 等[28]研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌中OPN 通過激活PI3K/AKT/mTOR 信號通路調(diào)控細胞自噬，且當OPN 基因敲低后會抑制αvβ3 誘導的細胞遷移和遷徙，而使PI3K/AKT/mTOR 途徑失活。本實驗在低氧條件下使用OPN 慢病毒降低OPN 表達后，PI3K、AKT、mTOR 蛋白表達降低，自噬相關指標表達升高；當在低氧條件下加入PI3K 抑制劑LY294002 后，自噬相關指標表達升高。這些結(jié)果表明OPN 可能通過PI3K/AKT/mTOR 信號通路抑制低氧誘導的PASMCs 自噬。

細胞增殖與細胞自噬之間具有密切聯(lián)系[29]。有研究發(fā)現(xiàn)，eIF2α 可以通過加速自噬途徑促進野百合堿誘導的PAH 大鼠PASMCs 的增殖和血管重塑[30]。劉琦[31]研究發(fā)現(xiàn)，葛根素可能通過抑制自噬的活化而減輕低氧誘導的PASMCs 異常增殖。商萍等[32]研究發(fā)現(xiàn)，傘形酮在抑制低氧誘導的PASMCs 自噬時可通過防止PASMCs 的過度增殖減緩HPAH 發(fā)展。Li 等[33]研究發(fā)現(xiàn)，mTOR 抑制劑可以上調(diào)Beclin1 表達并激活AMPK-ULK1 信號通路，上調(diào)自噬標志LC3Ⅱ/LC3Ⅰ以激活細胞的自噬活動，抑制PASMCs 增殖。王瑩等[34]研究發(fā)現(xiàn)，安石榴苷可以通過抑制AKT/NF-κB/Cyclin D1通路增強細胞自噬，抑制大鼠氣道平滑肌細胞增殖并誘導其凋亡。由此可知細胞自噬與細胞增殖緊密相關，且當不同的因子調(diào)控細胞自噬時細胞增殖變化不同。本實驗結(jié)果顯示，OPN 可抑制低氧誘導的PASMCs 自噬，促進低氧誘導的PASMCs增殖。但在低氧條件下OPN 調(diào)控的細胞自噬與增殖是否存在關系尚未明確，有待進一步研究。

綜上所述，低氧環(huán)境下OPN 可促進PASMCs增殖，并且通過PI3K/AKT/mTOR 信號通路抑制PASMCs 自噬。

致謝感謝青海大學高原醫(yī)學研究中心實驗室提供實驗平臺。

作者貢獻丁琦：細胞培養(yǎng)，實驗指標檢測，實驗數(shù)據(jù)分析處理，論文撰寫；陳辛玲、周銳：細胞培養(yǎng)；王澤：實驗數(shù)據(jù)分析處理；王生蘭、劉川川：實驗設計，文章校對；劉輝琦：文章校對。

利益沖突所有作者聲明無利益沖突。

數(shù)據(jù)共享聲明本篇論文相關數(shù)據(jù)可依據(jù)合理理由從作者處獲取，Email：1244939963@qq.com。