色譜檢測技術(shù)對食品真菌毒素的檢測方法研究

◎ 汪秀秀

（河南國康檢測技術(shù)有限公司，河南 鄭州 450000）

真菌毒素屬于一種特定的真菌，在一定條件下產(chǎn)生的一種小分子次生代謝物質(zhì)，廣泛存在于不同的食品中。在我國，已經(jīng)進行化學結(jié)構(gòu)確認的有400 多種真菌毒素，常見的毒素有黃曲霉毒素( AFs)、單端孢霉烯族化合物毒素(TCTs)、伏馬毒素( FBs)、赭曲霉毒素(OTA)、玉米赤霉烯酮等。其危害性較大，可能引起人類以及動物的急性或者慢性中毒現(xiàn)象，長期攝入可能引起基因的突變以及畸形現(xiàn)象，甚至誘發(fā)腫瘤等嚴重疾病。因此，世界衛(wèi)生組織將真菌毒素納入食品安全體系重點監(jiān)控項目范圍內(nèi)。對于食品中真菌毒素含量的檢測方法，主要有酶聯(lián)免疫法(ELISA)、液相色譜法(LC)、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)等。其中酶聯(lián)免疫法具有較高的靈敏程度，但是其重復性和專屬性相對較差，很容易出現(xiàn)假陽性的特點。液相色譜法的處理步驟較為煩瑣，且檢出的限定量都相對較高。高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法具有較為準確、高效的優(yōu)點，靈敏程度也相對較高。由于其步驟較為煩瑣且耗費的時間較長，因此，也屬于當前檢測工作主要改進的方向[1]。

1 真菌毒素的檢測

當前，在真菌毒素的檢測過程中，主要采用的處理方式是通過固相分散技術(shù)提取的方式來實現(xiàn)，MAX固相萃取小柱凈化技術(shù)。以此來對大米、面粉、玉米、豆制品、糕點、食用油、肉制品和水果等常見食品中的多種真菌毒素進行科學檢測，實現(xiàn)前處理步驟的有效簡化，降低檢測成本，提升檢測效率。

2 色譜檢測技術(shù)檢測方法應用

2.1 檢測樣品、設備

本研究將小麥和玉米代謝所產(chǎn)生的真菌毒素作為檢測的主要對象，檢測樣品主要為小麥和玉米，從市場當中獲取。檢測物質(zhì)有黃曲霉毒素、T-2 毒素、OTA、DON 等標準液，乙醇、乙腈等輔助液體。

檢測設備：安捷倫1260 高效液相色譜儀。

2.2 檢測方式

在實際檢測中，需根據(jù)糧食的真菌毒素檢測標準來完成對檢測樣品AFS、OTA、ZEN、DON、T-2 毒素標準液的配置，確保標準溶液的濃度符合檢測的實際要求。甲醇和水按照50 ∶50 的比例進行配置，將各種標準溶液稀釋成為檢測所需溶液。稱取粉末狀態(tài)的5.0 g 小麥和玉米樣品，將其均勻放置在5 個體積相等、環(huán)境相同的容器中，在不同的小麥樣品中添加AFS、OTA、ZEN、DON 及T-2 毒素標準液，制得檢測所需的樣品。利用安捷倫1260 高效液相色譜儀對不同小麥樣品中所含的真菌毒素波長進行有效檢測，其中安捷倫1260 高效液相色譜儀5 種毒素分別對應的發(fā)射波長為450 nm、460 nm、460 nm、無及無，其對應的激發(fā)波長分別為364 nm、332 nm、276 nm、220 nm 及 201 nm。對于小麥樣品而言，在真菌毒素的實際檢測過程中進行色譜柱的選擇需要滿足幾個方面的條件，分別為流動相A 為甲醇-乙腈溶液，流動相B 為0.1%的乙酸溶液。將配置完成的小麥和玉米樣品放入離心管內(nèi)，在其中加入20 mL 80%的乙腈溶液，保持30 min 的振蕩旋轉(zhuǎn)操作之后，再將其溶液放置常溫環(huán)境中，進行10 min 的離心處理且保持4 000 r·min-1的離心轉(zhuǎn)速，通過此種方式來對實際檢測的樣品進行提取[2]。

2.3 結(jié)果分析

在提取溶劑的優(yōu)化方面，本實驗主要對比了甲醇、乙腈、丙酮、1% 乙酸-乙腈、1%乙酸-甲醇，對以上幾種提取溶液的提取效果分析，最終發(fā)現(xiàn)利用1%的乙酸 -乙腈進行提取操作，目標化合物的回收率都滿足要求，回收率高于78.1%且干擾較少。因此，可以乙腈作為提取液來進行分析實驗研究。

在凈化條件的優(yōu)化方面，采用EN15662 的凈化方式來對不同比例下的PSA 和C18 進行凈化操作。在實驗的過程中，對多種真菌毒素的回收率和基質(zhì)效應在應用過程中產(chǎn)生的影響進行分析之后，可以確定最終的凈化目標化合物為150 mg 的PSA，200 mg 的C18，1 200 mg 的MgSO4。

對于色譜條件的優(yōu)化，在試驗的過程中要對多種溶液進行分析和對比，比如甲醇-水、乙腈-水、0.05%甲酸水-0.05%甲酸甲醇、0.05%甲酸水-0.05%甲酸乙腈、甲醇-10 mmoL·mL-1乙酸銨溶液，將其作為流動相進行洗脫操作。實驗發(fā)現(xiàn)，在甲醇-水和乙腈-水的體系當中，出現(xiàn)了多種現(xiàn)象，比如峰型差、拖尾以及有雜峰等現(xiàn)象；0.05%的甲酸水-0.05%的甲酸甲醇是流動相洗脫的過程當中，分離度最好且響應值都相對良好的物質(zhì)。因此，流動相可以選擇0.05%的甲酸水-0.05%的甲酸甲醇物質(zhì)[3]。

最終方式的驗證，需要經(jīng)過多種方式來進行驗證操作。對于標準曲線和檢出限進行驗證，要基于真菌毒素的實際情況進行響應強弱的分析，對不同質(zhì)量濃度的混合標準溶液標準曲線進行配置。各個真菌毒素的面積峰值用Y來表示，質(zhì)量濃度用X來表示，將兩者利用線性回歸方程進行操作對比，其中的基質(zhì)屬于空白樣品。經(jīng)過測試得出結(jié)論：在多種真菌毒素中，2～100 ng·mL-1的范圍內(nèi)線性關系系數(shù)處于0.996 68～0.999 94 的范圍之間。根據(jù)多種真菌毒素在質(zhì)譜MRM 模式下的不同操作方式，可以將其配置成多種濃度的混合標準溶液。實驗中，以藜麥空白樣品作為基質(zhì)，對其添加多種真菌毒素的混合標準溶液進行實驗，根據(jù)樣品的前處理方式方法進行操作。對其進行測定分析之后，按照3 倍的信噪比分析得出最低檢出限，也就是LOD，根據(jù)10 倍的信噪比分析得出最低的定量限。產(chǎn)生的結(jié)果如表1 所示，其中，真菌毒素的檢出限范圍為0.75 μg·kg-1～3.74 μg·kg-1，定量限的檢出范圍為2.20 μg·kg-1～11.00 μg·kg-1之間。

表1 多種真菌毒素標準溶液通過 LC-MS-MS 分析所得的標準工作曲線、相關系數(shù)、檢出限、定量限表

在回收率和精密度方面進行分析，將藜麥空白谷物作為樣品進行分析，在其中添加多個水平的真菌毒素緩和標準溶液，包含低、中以及高3 個水平階段，根據(jù)上述的處理步驟進行對應的前處理操作之后可以對其作出科學測定[4]。對每個不同階段的水平進行測試的實驗要達到6 次以上，分析得出真菌毒素的平均回收率處于78.1～102.3區(qū)間，相對標準偏差處于1.0～7.7之間。

根據(jù)檢測結(jié)果可以得出最終結(jié)論，其中，最佳流動相包含幾個方面的內(nèi)容，對于35%的流動相A 和65%的流動相B 混合溶液，0～11 min 之內(nèi)可以達到混合狀態(tài)。對于55%的流動相A 和65%的流動相B，11～23 min 內(nèi)達到混合狀態(tài)。對于35%的流動相A 和65%的流動相B 來說，可以在23～38 min 之內(nèi)達到混合的狀態(tài)。因此，利用提取和凈化的方式可以最大限度提升檢測的準確率[5]。

3 結(jié)語

綜上所述，利用色譜檢測技術(shù)對小麥和玉米中的AFS、OTA、ZEN、DON 及 T-2 真菌毒素進行分析，具備較高的靈敏性，在真菌毒素的檢測回收率方面也相對較高，好于其他檢測方式方法。因此，在糧食真菌毒素檢測方面要大力推廣色譜檢測技術(shù)，為我國的糧食安全提供更加有效的保障。