以紫菜多糖為原料高產乙醇酵母的篩選與鑒定

◎ 蘇 芳，段志成

（1.近海流域環境測控治理福建省高校重點實驗室，福建 福清 350300；2. 福建技術師范學院， 福建 福清 350300）

目前，全球范圍內存在能源緊缺問題，各國都在積極研究和開發新能源。生物燃料（生物乙醇和生物柴油）作為可再生的新型能源，是解決能源問題的一條重要途徑。目前，幾乎所有的生物乙醇是通過陸地糧食作物發酵產生，但世界上糖物質和谷物量是有限的，并且乙醇生產的原料成本相對昂貴。同時，將這些作物用于生產乙醇，勢必會與人類食品需求發生競爭，其可能導致谷物和糖的價格上漲至較高水平，從而影響民生[1]。此外，種植這些作物需要大量的耕地，而耕地面積是有限的，這就導致其生產規模的不可持續[2]。全球海洋面積占地球表面積的71%，有豐富的海藻資源，每年單位面積內的生物質產量遠高于陸地生物質[3]。不僅如此，海藻不僅可節約淡水資源、不占耕地、不需要噴灑農藥和施加化肥，還可以轉化溫室氣體CO2，是解決生物乙醇發展瓶頸的重要途徑[4]。對于利用藻類多糖進行生物乙醇生產來說，酵母的發酵能力是關鍵。紫菜中含有大量的紫菜多糖，一般酵母難以降解利用。本文以紫菜多糖為底物進行高產乙醇菌株的篩選鑒定，并對其發酵性能進行研究，旨在為將來以紫菜為原料進行乙醇工業化生產奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

土壤（福建技術師范學院五馬山校區篤思公園內菜地）；酒曲（購自哈爾濱正中醇酒曲廠）；腐爛紫菜、腐爛獼猴桃、腐爛桑椹；紫菜多糖購自植提橋(西安)大健康產業咨詢有限公司。

富集培養基：一水合葡萄糖50 g/L、半乳糖50 g/L、酵母浸膏2 g/L、細菌學蛋白胨10 g/L、磷酸氫二鉀0.5 g/L、七水合硫酸鎂0.2 g/L，調節pH 為7.2（滅菌后加入無水乙醇10 g/L）。

篩選培養基：紫菜多糖粉30 g/L、酵母浸膏2 g/L、細菌學蛋白胨10 g/L、磷酸氫二鉀0.5 g/L、七水合硫酸鎂0.2 g/L、瓊脂粉15 g/L，調節 pH 至 7.2（滅菌后加入無水乙醇10 g/L）。

活化培養基：紫菜多糖粉30 g/L、酵母浸膏2 g/L、細菌學蛋白胨10 g/L、磷酸氫二鉀0.5 g/L、七水合硫酸鎂0.2 g/L，調節 pH 至 7.2（滅菌后加入無水乙醇10 g/L）。

發酵培養基：紫菜多糖粉70 g/L、豆粕粉8 g/L。

PDA 培養基：PDA 培養基39 g/L。

麥芽汁培養基：麥芽汁培養基130 g/L。

產子囊孢子斜面培養基：麥芽汁培養基3 g/L、一水合葡萄糖10 g/L、酵母浸膏3 g/L、細菌學蛋白胨5 g/L、瓊脂粉2 g/L。

氮源基礎培養基：YNB 培養基68 g/L，使用前稀釋 10 倍。

碳源基礎培養基：一水合葡萄糖20 g/L、磷酸二氫鉀1 g/L、氯化鈉1 g/L、硫酸鎂0.5 g/L、氯化鈣0.1 g/L。

1.2 試驗方法

1.2.1 紫菜多糖發酵菌株篩選

取10 g 分離試樣置于內含90 mL 富集培養基的250 mL 三角瓶中，在水浴恒溫振蕩器上120 rmp，37 ℃富集24 h。

取富集培養基培養后的培養基進行10 倍梯度稀釋（ 10-2、10-3、10-4），隨后將3 個稀釋后的溶液涂布于篩選培養基上，置于37 ℃培養箱培養直至長出明顯菌落。各樣品按照各稀釋梯度設置 3 組平行。

從上述平板中挑選出典型菌落進行四區劃線分離、純化。由于能利用紫菜多糖發酵高產乙醇的菌株會消耗篩選培養基平板中的紫菜多糖，菌株周圍會產生透明圈，因此需要觀察透明圈的大小，篩選出透明圈較大的菌落，重復上述四區劃線純化3 次。

1.2.2 紫菜多糖發酵菌的發酵實驗

將篩選所得的菌株分別活化后接入裝有100 mL 發酵培養基的三角瓶中，在120 rpm、37 ℃條件下，厭氧發酵96 h。將發酵液11 000 rpm 離心10 min 后移取上清液1 mL 至50 mL 容量瓶中定容將其稀釋。隨后，采用重鉻酸鉀-比色法測量乙醇含量，選出高產乙醇得率最高的菌株。

1.2.3 乙醇濃度的測定

乙醇濃度的測定采用重鉻酸鉀-比色法[4]。以 5%乙醇標準液作參比，在600 nm 的波長下，測定不同乙醇濃度的吸光度，繪制標準曲線，得出回歸方程，再根據回歸方程得到5 mL 稀釋樣品中的乙醇含量，再換算成發酵上清液中的乙醇含量。

1.2.4 糖度的測定

DNS（3,5-二硝基水楊酸）法[5]。

1.2.5 菌株常規鑒定

常規鑒定內容主要包括形態學特征、生理特征和生理生化特征。這些常規分類鑒定指標的鑒定方法，需根據國際微生物酵母分類中所描述的標準方法進行[6-8]。

1.2.6 生理生化特征

同化碳源試驗：在氮源基礎培養基中，分別加入適量半乳糖、赤蘚糖醇、棉子糖、可溶性淀粉、蔗糖、木糖、麥芽糖、纖維二糖、甘露醇、海藻糖、阿拉伯糖、檸檬酸、核糖、肌醇、鼠李糖作為碳源，使其濃度為50 mmol/L，經0.22 μm 濾膜過濾后，分裝到試管中。以僅含有氮源基礎培養基的試管作為菌株不生長的空白對照，隨后在各試管中接入1 環活化后實驗菌株，在37 ℃條件下培養，在第1 周和第2 周觀察。觀察前，將菌液充分混勻，試管中出現渾濁計為“+”，澄清計為“-”。

發酵糖類試驗：在氮源基礎培養基中，分別加入適量葡萄糖、半乳糖、蔗糖、棉子糖、麥芽糖、核糖，使其濃度為50 mmol/L。0.22 μm 濾膜過濾后，分裝到試管中，加入杜氏發酵罐后，各試管中接入1 環活化后實驗菌株，在37 ℃條件下培養，每天觀察有無氣泡產生，有氣泡計為“+”，無氣泡計為“-”。

同化氮源試驗：在碳源基礎培養基中，分別加入硝酸鉀、硫酸銨、賴氨酸、亞硝酸鈉作為氮源，使其濃度達到50 mmol/L，經0.22 μm 濾膜過濾后，分裝到試管中。以僅含有碳源基礎培養基的試管作為菌株不生長的空白對照。隨后在各試管中接入1 環活化后實驗菌株，在37 ℃條件下培養，在第1 周和第2 周觀察。觀察前將菌液充分混勻，試管中出現渾濁計為“+”，澄清計為“-”。

1.2.7 菌株分子生物學鑒定

篩選分離菌株分子測序由都拜特生物有限公司完成。正反測序引物分別為鑒定酵母常用引物NL1（5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’）和NL4（5’- GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’）。 測序結果查詢NCBI 數據庫，使用Blast 在線軟件進行相似性分析。

2 結果與分析

2.1 菌株篩選

以紫菜多糖為唯一碳源進行篩選，通過比較透明圈大小，篩得紫菜多糖分解能力較強的3 個菌株。將這些菌株接種進行乙醇發酵并測定乙醇產量，篩選出1 株在紫菜多糖濃度70 g/L 的發酵培養基中乙醇產量達49.9 g/L 的高產菌株J1（酒曲來源）。

2.2 菌種鑒定

2.2.1 形態特征觀察

由圖1 可以看出，J1 菌株的細胞顯微形態呈卵圓形，無性生殖方式為芽殖且為一端芽殖（如圖1A）；有假菌絲（如圖1B）和子囊孢子形成（如圖1C），且子囊孢子數量較少；菌落較小，質地呈奶酪狀、粘稠、乳白色，有隆起，邊緣較為整齊，容易被接種環挑起（如圖1D）。

圖1 菌株J1 的形態特征圖

2.2.2 生理生化鑒定

菌株J1 在1 周內能同化半乳糖、棉子糖、可溶性淀粉、蔗糖、木糖、麥芽糖、纖維二糖、甘露醇、海藻糖、阿拉伯糖、檸檬酸、核糖，不能同化赤蘚糖醇、鼠李糖和肌醇，但到第2 周結束后可同化所有供試碳源（見表1）；能發酵蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、半乳糖、棉子糖、核糖，但對棉子糖、半乳糖和核糖發酵能力相對較弱（見表2）；能同化硝酸鉀、硫酸銨、賴氨酸、亞硝酸（見表3）。

表1 同化碳源試驗結果表

表2 糖發酵試驗結果表

表3 氮同化實驗結果表

2.2.3 分子生物學鑒定

通過使用引物NL1 和NL4 對所篩菌株J1 進行26S rRNA 的基因序列進行擴增，得到大小為594 bp 的序列片段。經Blast 在線軟件進行相似性分析并使用MEGA7 構建系統發育樹后發現，菌株J1 以較高的置信度和釀酒酵母菌株Saccharomyces cerevisiae Y_1 聚于內群的同一分支上，同源相似度99.65%（如圖2 所示）。說明J1 與釀酒酵母菌株Saccharomyces cerevisiae Y_1具有較近的親緣關系，屬于同一物種。因此，結合形態、生理生化特性及分子生物學測試結果，菌株J1 被鑒定為Saccharomyces cerevisiae J1。

圖2 菌株J1 的系統發育樹圖

3 結論

本研究通過分離和篩選，得到一株能夠分解紫菜多糖高產乙醇含量達49.9 g/L 的菌株J1。經生理生化鑒定和分子生物學鑒定，證實菌株J1 為 Saccharomyces cerevisiae J1。因此，本研究可以作為利用紫菜多糖提取乙醇酵母的依據。