BMSCs對骨質疏松性骨折模型大鼠的影響及作用機制

李楊 陳勇 白亮 李偉 孟勇 曾慶亮 趙耀偉 張雷 王葉密 莊全魁

(阜陽市第二人民醫院骨外科,安徽 阜陽 236000)

骨質疏松多發生于老年人群,因成骨與破骨代謝平衡紊亂導致骨脆性增加,骨折風險明顯提升,對患者生存質量造成嚴重不良影響〔1〕。對于老年骨質疏松患者臨床多采取藥物治療,包括骨吸收抑制劑、促進骨形成的藥物等,但僅能起到一定的減緩作用,治療效果不理想〔2〕。近年研究發現,骨髓間充質干細胞(BMSCs)的分化與凋亡參與骨質疏松的病理機制〔3〕。BMSCs是一種具備多向分化潛能的成體干細胞群,便于獲取且體外培養難度不高〔4〕。目前BMSCs以體外細胞學研究為主〔5〕,在骨質疏松性骨折大鼠中的作用效果及可能機制的研究仍十分少見。本研究分析BMSCs對骨質疏松性骨折模型大鼠的影響及作用機制。

1 材料與方法

1.1動物與主要試劑 雌性Wistar大鼠48只,體質量(270±10)g,購于安徽省盛鵬實驗動物科技有限公司,實驗動物許可證編號:SCXK(皖)2020-002,自由進食、進水,每日12 h光照。胰蛋白酶、DMEM培養基、胎牛血清均購于北京科美圖生物科技有限公司;骨堿性磷酸酶、Ⅰ型膠原交聯C-末端肽酶聯免疫檢測試劑盒購于上海研謹生物科技有限公司。

1.2大鼠BMSCs原代提取及培養 將大鼠斷髓處死,放入乙醇溶液中浸泡后取下股骨、脛骨,轉入磷酸緩沖液中浸泡。使用手術刀將股骨、脛骨表面的軟組織去除,同時切除干骺端,暴露髓腔。無菌注射器吸取細胞培養液沖洗髓腔,觀察髓腔顏色變白后停止沖洗。2 000 r/min 4 ℃恒溫離心15 min。棄去上層脂肪,向沉淀細胞中加入適量的細胞培養液,吹打后得到單細胞懸液。接種至培養瓶中,再加入細胞培養液,放入細胞培養箱中,條件設置為37 ℃、5%CO2,培養3 d后半量更換細胞培養液,之后每2 d全量更換細胞培養液。光學顯微鏡下觀察細胞生長情況,當BMSCs融合度超過90%時,棄去細胞培養液,磷酸緩沖液洗滌,0.25%的胰蛋白酶消化3 min,顯微鏡下觀察BMSCs脫壁情況,加入細胞培養液消化后,轉移到離心管中,2 000 r/min 4 ℃恒溫離心15 min,棄去上清液。將BMSCs接種到細胞培養瓶中傳代培養,培養至第3代,流式細胞術檢測間充質干細胞表面標志物。

1.3大鼠骨質疏松性骨折模型構建 大鼠禁食6h后麻醉,仰臥位固定到手術臺上。使用手術刀將大鼠下腹部皮膚切開,分離淺筋膜、深筋膜至肌層,分離輸卵管并定位卵巢。隨機選取16只大鼠為假手術組,開腹后立即進行皮膚縫合;另外的32只大鼠隨機分為骨質疏松性骨折組、BMSCs處理的骨質疏松性骨折組,每組16只,兩組結扎輸卵管峽部,切除雙側卵巢后縫合。常規喂養60 d后測定各組的骨密度,當骨密度<1.05 g/cm2時提示骨質疏松模型成功構建。再次麻醉大鼠,仰臥位固定到手術臺上,將腰椎1～5椎體皮膚切開,暴露腹膜后間隙,分離背闊肌、棘間肌、背最長肌、韌帶,腰椎1～5椎間盤暴露后于錐體側前端剪斷椎體,分層縫合。

1.4大鼠分組處理及標本采集 建模成功后滿2月,骨質疏松性骨折組、假手術組向兩側股骨髓腔中注射生理鹽水,注射體積為20 μl;BMSCs處理的骨質疏松性骨折組向兩側股骨髓腔中注射BMSCs,注射體積為20 μl;將股骨鉆孔區使用骨蠟密封,縫合股骨遠端肌肉和皮膚。繼續常規喂養2 w,采集各組大鼠的腹主動脈血3 ml,麻醉后處死,取骨折端組織、腰椎1～5椎體,保存待用。

1.5骨生物力學變化情況 取各組組織標本,對右側股骨進行三點彎曲試驗,測定生物力學性能,具體為:兩端跨距20 mm,下壓速度5 mm/min,觀察骨組織標本斷裂后停止。同時對大鼠腰椎1～5椎體進行壓縮試驗,測量彈性模量、最大載荷。

1.6骨密度和骨超聲振幅衰減測定 將各組大鼠固定在掃描臺上,掃描大鼠的脊柱,根據測量得到的圖像長度平均分為4個區域,測定各區域的骨密度值;同時對各組進行骨超聲振幅衰減測定,記錄超聲衰減幅度。

1.7椎體骨組織形態學指標測量 取各組大鼠的L5椎體,進行標本制備,使用圖像分析系統測量骨組織形態,包括:骨小梁體積百分比=骨髓腔體積/骨小梁體積×100%;骨小梁表面百分比:骨小梁總表面不規則、凹凸骨小梁表面占比;骨小梁平均寬度;礦化沉積率=單位時間內新礦化的骨厚度。

1.8血清骨堿性磷酸酶、Ⅰ型膠原交聯C-末端肽水平檢測 取各組血液標本,3 000 r/min 4 ℃恒溫離心10 min,收集血清,酶聯免疫吸附試驗檢測血清骨堿性磷酸酶、Ⅰ型膠原交聯C-末端肽水平,使用酶標儀讀取450 nm處的吸光度值,以標準品繪制標準曲線,計算各樣本濃度。

1.9統計學分析 采用SPSS25.0軟件,多組間比較進行方差分析,兩組間比較進行t檢驗。

2 結 果

2.1BMSCs的培養與鑒定 BMSCs接種到細胞培養瓶后連續培養2 d,待完成全量換液(舊培養液完全棄去,加入新的培養液),顯微鏡下觀察BMSCs貼壁生長,呈多角形,間充質干細胞多數呈纖維細胞樣生長,形態為不規則三角形或棱形,細胞核為卵圓形,細胞質常向外延伸出數個長短不同的突起。BMSCs傳代培養后均勻排列,幾乎所有間充質干細胞均貼壁生長,觀察細胞培養瓶底部的細胞鋪滿率達到80%以上時,開始傳代培養至第3代,保存待用。流式細胞術檢測間充質干細胞表面標志物結果顯示,白細胞分化抗原(CD)34陽性率≤5%,CD44、CD29、CD105陽性率均≥90%,與間充質干細胞的鑒定標準相符合。見圖1。

2.2各組骨生物力學改變情況分析 右側股骨和L5椎體的彈性模量、最大載荷在各組間比較差異均有統計學意義(P<0.05);骨質疏松性骨折組上述指標明顯低于假手術組,BMSCs處理的骨質疏松性骨折組上述指標明顯高于骨質疏松組(P<0.05)。見表1。

表1 各組骨生物力學改變及血清骨堿性磷酸酶、Ⅰ型膠原交聯C-末端肽水平比較

2.3各組血清骨堿性磷酸酶、Ⅰ型膠原交聯C-末端肽水平比較 血清骨堿性磷酸酶、Ⅰ型膠原交聯C-末端肽水平在各組間比較差異均有統計學意義(P<0.01);骨質疏松性骨折組血清骨堿性磷酸酶明顯低于假手術組,Ⅰ型膠原交聯C-末端肽水平明顯高于假手術組(P<0.01);BMSCs處理的骨質疏松性骨折組血清骨堿性磷酸酶明顯高于假手術組,Ⅰ型膠原交聯C-末端肽水平明顯低于假手術組(P<0.01)。見表1。

2.4各組椎體骨組織形態學指標測量結果比較 骨小梁體積百分比、骨小梁表面百分比、骨小梁平均寬度、礦化沉積率在各組間比較,差異均有統計學意義(P<0.01);骨質疏松性骨折組骨小梁體積百分比、骨小梁平均寬度明顯低于假手術組,骨小梁表面百分比、礦化沉積率明顯高于假手術組;BMSCs處理的骨質疏松性骨折組骨小梁體積百分比、骨小梁平均寬度明顯高于骨質疏松性骨折組,骨小梁表面百分比、礦化沉積率明顯低于假手術組(P<0.05)。見表2。

表2 各組骨密度、超聲衰減情況、椎體骨組織形態學指標測量結果比較

2.5各組骨密度和超聲衰減情況比較 骨密度、超聲衰減程度在各組間比較差異均有統計學意義(P<0.01);骨質疏松性骨折組上述指標明顯低于假手術組,BMSCs處理的骨質疏松性骨折組上述指標明顯高于骨質疏松性骨折組(P<0.05)。見表2。

3 討 論

老年人群身體器官處于衰退階段,會影響骨代謝、骨形成、骨吸收過程,鈣、磷等元素代謝紊亂,骨組織質量和骨密度降低,骨脆性增加,出現老年性骨質疏松〔6,7〕。同時骨質疏松患者的骨密度下降,骨吸收增強,導致骨強度降低,骨折發生風險增加,臨床多表現為駝背、疼痛等,嚴重降低患者的生存質量〔8〕。研究顯示,骨質疏松會降低BMSCs的生長、增殖及成骨分化活性,使自成骨細胞的成骨活性減弱〔9〕.使用正常狀態的BMSCs對骨質疏松患者進行局部注射時能夠明顯改善骨質疏松部位的骨結構,觀察發現BMSCs具有增殖速度快、多向分化潛能大的優勢,因此在免疫調節組織修復、細胞療法等方面的應用潛力較大〔10〕。本研究說明,骨質疏松性骨折大鼠骨生物力學下降明顯,給予BMSCs處理能夠有效提升骨生物力學指標,進而促進骨折愈合。

目前臨床主要通過骨密度和超聲衰減情況檢測來診斷和預測骨質疏松,同時作為藥物療效評估的定量參數用于治療方案的制定。本研究提示,BMSCs對骨質疏松性椎體骨折的骨密度具有較好的治療作用。椎體骨組織形態學指標骨小梁體積百分比、骨小梁平均寬度可用于對骨量的評估,全面反映骨形成情況〔11〕,骨小梁表面百分比、礦化沉積率是骨吸收的關鍵指標〔12〕。本研究結果提示,BMSCs能夠糾正骨吸收大于骨形成的狀態,促使骨質疏松性骨折組織變緊密,骨小梁變粗大,明顯提升骨折愈合的水平。成骨細胞分泌的骨堿性磷酸酶能夠水解無機磷酸鹽,減弱無機磷酸鹽對骨鹽的抑制作用,加速骨形成,血清骨堿性磷酸酶水平越低,骨質疏松的發生率越高〔13〕。Ⅰ型膠原交聯C-末端肽水平變化能夠敏感的反映骨吸收情況,且具有較高的特異性〔14〕。相關研究顯示,骨質疏松患者血清Ⅰ型膠原交聯C-末端肽水平明顯升高,對骨質疏松病情進展具有一定的預測價值〔15〕。本研究說明,BMSCs具有提高骨質疏松大鼠骨形成速率,降低骨吸收速率的作用,可能與提高骨堿性磷酸酶表達,降低Ⅰ型膠原交聯C-末端肽表達有關。