狼毒大戟調節AGE-RAGE信號通路對肝硬化大鼠炎癥反應和纖維化的影響

劉露 劉占奎 吳雪 鮑婷琦

(齊齊哈爾市第一醫院藥學部,黑龍江 齊齊哈爾 161005)

肝硬化是指由于長期損害導致肝臟無法正常運作,進而引起肝組織瘢痕形成,是一種以晚期纖維化、再生結節形成和血管重塑為特征的彌散過程,其發生在肝損傷的其他階段之后,也被稱為肝病終末期〔1,2〕。肝移植是治療終末期肝硬化最有效的方法,但供體短缺、并發癥風險仍然是當前存在的問題〔3〕。因此,迫切需要新的治療方法來替代肝移植。晚期糖基化終產物(AGEs)是通過糖分子和蛋白質結合的非酶促反應形成的,并且通常在健康個體中的存在程度較低〔4〕。AGEs可通過與其細胞表面受體-糖基化終產物受體(RAGE)相互作用,激活下游信號級聯〔5〕。有研究發現,AGE-RAGE相互作用能夠導致肝臟脂肪堆積,從而引起炎癥、纖維化及脂肪肝疾病等其他并發癥〔6〕。狼毒大戟具有抗炎、抗菌、抗病毒和抗腫瘤等多種活性〔7〕。目前已有研究發現,狼毒大戟配伍大棗能夠有效減輕肝硬化大鼠的增生程度〔8〕。但其具體的分子作用機制還不了解。本研究旨在探討狼毒大戟是否可以通過調節AGE-RAGE信號通路來減輕肝硬化大鼠的炎癥反應和纖維化程度。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 SPF級SD雄性大鼠60只,體質量為180～210 g,購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司,許可證號:SCXK(湘)2019-0004。

1.1.2主要試劑 狼毒大戟(HPLC≥98%,上海雅吉生物科技有限公司);復方鱉甲軟肝片(內蒙古福瑞醫療科技股份有限公司,國藥準字Z19991011);丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)檢測試劑盒(貨號:SH-1271、SH-1273,北京凱詩源生物科技有限公司);透明質酸(HA)、Ⅳ型膠原(CⅣ)、層黏蛋白(LN)、Ⅲ型前膠原(PCⅢ)檢測試劑盒(貨號:XY-SJH-3630、XY-SJH-3407、XY-SJH-3874、XY-SJH-3686,上海烜雅生物科技有限公司);腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-6和IL-8試劑盒(貨號:SBJ-R0040、SBJ-R0755、SBJ-R0033,南京森貝伽生物科技有限公司);蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(貨號:YT8991,北京伊塔生物科技有限公司);AGE、RAGE一抗(貨號:ab23722、ab216329,英國abcam公司);山羊抗兔IgG二抗(貨號:FNab09778,武漢菲恩生物科技有限公司)。

1.2大鼠模型建立 將大鼠先進行適應性飼養1 w,然后隨機分為兩組,第一組作為對照組(n=15)用正常飼料飼養,第二組(n=45)參照文獻〔9〕方法建立肝硬化大鼠模型,通過腹腔注射5 ml/kg的40%四氯化碳(CCl4,稀釋于橄欖油中)誘導肝硬化,每周注射2次,持續8 w。

1.3大鼠分組及給藥 將建立模型的第二組大鼠分為模型組、陽性組、狼毒大戟組,每組15只。陽性組大鼠以0.8 g/kg的劑量灌胃給藥復方鱉甲軟肝片〔10〕,狼毒大戟組灌胃給予30 mg/kg的狼毒大戟提取物〔8〕,對照組和模型組均灌胃給予等體積生理鹽水。每周2次,共持續4 w。

1.4檢測大鼠血清肝功能酶-ALT、AST和肝纖維化四項-HA、CⅣ、LN和PCⅢ的含量 將所有大鼠使用1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉,然后腹主動脈采血,3 000 r/min離心15 min,收集上清并保存于-20 ℃備用。分別利用試劑盒檢測肝功能酶和肝纖維4項中各項指標的含量。

1.5酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測大鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-8的含量 取1.2中凍存的血清置于冰上溶解,先分別利用ELISA試劑盒中的標準品制作標準曲線,然后根據操作步驟處理待測樣品,并用酶標儀檢測待測樣品在450 nm處的吸光值,并根據標準曲線計算TNF-α、IL-6、IL-8的含量。

1.6HE染色觀察大鼠肝組織病理學形態 將所有大鼠麻醉后處死,取肝組織凍存于-80 ℃。然后在每組中隨機取5只大鼠的肝組織于4%多聚甲醛中固定過夜,并進行石蠟包埋和切片。然后將切片在梯度乙醇中脫水,用二甲苯清潔,并用蒸餾水洗滌。隨后,切片用蘇木素染色4 min,再用伊紅溶液染色2 min。然后,將切片分別用梯度乙醇和二甲苯脫水透明,最后用中性膠封片,在光學顯微鏡下觀察肝組織病理學變化。

1.7RT-qPCR檢測肝組織中α-SMA和ColⅠ mRNA的表達 從1.5中凍存的肝組織中每組隨機選取5個,提取總RNA,然后根據一步法熒光定量試劑盒配制總反應體系25 L,反應程序:50 ℃逆轉錄3 min;95 ℃預變性30 s;2步法:95 ℃變性10 s,60 ℃退火30 s,40個循環,熔解曲線95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,95 ℃ 15 s。以GAPDH為內參,采用2-ΔΔCt法計算mRNA的相對表達量。引物序列如下:α-SMA:上游 5′-CAATGGCTCCGGGCTCTGTA-3′,下游 5′-CTCTTGCTCTGCGCTTCGTC-3′;ColⅠ:上游 5′-CCTTTCTCCACCCCCTCTT-3′,下游 5′-TGTGTCTT TGGGGGAGACTT-3′;GAPDH:上游 5′-CTGGGCTACACTGAGCACC-3′,下游 5′-AAGTGGTCGTTGAG-GGCAATG-3′。

1.8Western印跡檢測肝組織中AGE、RAGE蛋白的表達 取1.5中剩余的肝組織加入蛋白裂解液提取總蛋白,并利用二喹啉甲酸(BCA)試劑盒測定蛋白質含量。然后用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白,并轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。再將PVDF膜放入5%脫脂牛奶封閉液中常溫孵育2 h,然后與一抗稀釋液(AGE、RAGE稀釋比例1∶1 000)在4 ℃孵育過夜,接著與山羊抗兔IgG二抗稀釋液(1∶1 000)在室溫下孵育1 h。最后加入顯影劑顯色。以GAPDH為內參,分別用蛋白凝膠成像系統和ImageJ軟件觀察蛋白條帶并分析蛋白相對表達量。

1.9統計學分析 采用GraphPad Prism8.0軟件進行方差分析,兩兩比較采用SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1狼毒大戟對肝硬化大鼠血清中肝功能指標的影響 與對照組相比,模型組、陽性組、狼毒大戟組血清中肝功能指標ALT、AST含量明顯升高(P<0.05);與模型組相比,陽性組和狼毒大戟組血清中肝功能指標ALT、AST含量明顯降低(P<0.05),且狼毒大戟組與陽性組無顯著差異(P>0.05),見表1。

表1 各組血清中肝功能指標、肝纖維化4項水平比較

2.2狼毒大戟對肝硬化大鼠血清中肝纖維化4項指標的影響 與對照組相比,模型組、陽性組、狼毒大戟組血清中肝纖維化4項指標HA、CⅣ、LN和PCⅢ含量明顯升高(P<0.05);與模型組相比,陽性組和狼毒大戟組血清中肝纖維化4項指標HA、CⅣ、LN和PCⅢ含量明顯降低(P<0.05),且狼毒大戟組與陽性組無顯著差異(P>0.05),見表1。

2.3狼毒大戟對肝硬化大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-8含量的影響 與對照組相比,模型組中、陽性組、狼毒大戟組血清中TNF-α、IL-6、IL-8含量明顯升高(P<0.05);與模型組相比,陽性組和狼毒大戟組血清中TNF-α、IL-6、IL-8含量明顯降低(P<0.05),且狼毒大戟組與陽性組無顯著差異(P>0.05),見表2。

表2 各組血清中TNF-α、IL-6、IL-8含量及肝組織中α-SMA、ColⅠ mRNA、AGE、RAGE蛋白水平比較

2.4狼毒大戟對肝硬化大鼠肝組織中α-SMA和ColⅠ mRNA水平的影響 與對照組相比,模型組、陽性組、狼毒大戟組肝組織中α-SMA和ColⅠ mRNA水平明顯升高(P<0.05);與模型組相比,陽性組和狼毒大戟組肝組織中α-SMA和ColⅠ mRNA明顯降低(P<0.05),且狼毒大戟組與陽性組無顯著差異(P>0.05),見表2。

2.5狼毒大戟對肝硬化大鼠肝組織中AGE、RAGE蛋白表達的影響 與對照組相比,模型組、陽性組、狼毒大戟組肝組織中AGE、RAGE蛋白表達明顯升高(P<0.05);與模型組相比,陽性組和狼毒大戟組肝組織中AGE、RAGE蛋白表達明顯降低(P<0.05),且狼毒大戟組與陽性組無顯著差異(P>0.05),見表2、圖1。

1～4:對照組、模型組、陽性組、狼毒大戟組圖1 各組肝組織中AGE、RAGE蛋白表達

2.6狼毒大戟對肝硬化大鼠肝組織的影響 與對照組相比,模型組肝組織中細胞排列紊亂,細胞出現腫脹,纖維組織增生,肝小葉結構被破壞;與模型組相比,陽性組和狼毒大戟組肝組織中細胞整體排列有序,纖維化程度減輕,細胞腫脹和纖維增生明顯減少,見圖2。

圖2 各組肝組織的病理形態(HE染色,×400)

3 討 論

肝硬化是與肝細胞損傷和炎癥相關的慢性肝病末期。在組織學上,肝硬化的特征是彌漫性結節狀再生,周圍環繞著纖維化隔膜〔11〕。在肝硬化發展中,雖然肝移植是一個可行的治療選擇,但其存在缺乏供體器官、免疫排斥和術后并發癥等多種限制,且尚無治療肝硬化的有效藥物用于臨床。因此,迫切需要一種不同類型的治療方法〔12,13〕。狼毒大戟首載于《神農本草經》,其以根入藥,味辛、性平、有毒,其主要包括二萜類、三萜類、香豆素類、酚酸類、淄醇類等多種活性成分,具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤及抗癲癇等多種藥理作用〔14〕。本研究結果表明,狼毒大戟通過抑制肝功能酶的含量減輕肝功能損傷。已知肝硬化也是肝纖維化和肝臟炎癥導致的終末期肝病,其中肝星狀細胞的激活是肝纖維化的關鍵步驟,因為它會導致α-SMA和ColⅠ的積累〔15〕。炎癥作為慢性肝病的主要特征,可以發生在纖維化過程的任何階段,并引起TNF-α、IL-6、IL-8等促炎因子的分泌〔16〕。本研究結果揭示,狼毒大戟可以抑制肝硬化大鼠的炎癥反應和纖維化程度,并且減輕肝組織病理性損傷;但其作用機制還尚未了解。

已知AGEs是由葡萄糖或其他糖類對包括蛋白質、脂質和核酸在內的大分子進行翻譯后非酶修飾而產生的異質分子。AGE是有害分子,在生理衰老和年齡相關疾病、糖尿病、類風濕關節炎及系統性硬化癥等疾病中增加〔17〕。RAGE是AGE的細胞結合受體,兩者相互作用可以激活NADPH氧化酶和核因子(NF)-κB,從而導致各種炎癥基因的轉錄激活〔18,19〕。有研究AGEs通過自噬誘導和肝星狀細胞激活在慢性丙型肝炎患者的纖維化或肝硬化中發揮作用,阻斷AGE-RAGE信號可能是緩解纖維化的一種有前途的方法〔20〕。本研究推測狼毒大戟對肝硬化大鼠炎癥和纖維化的減輕作用可能是通過抑制AGE-RAGE信號通路實現的,且與陽性藥物的效果無顯著差異。

綜上,狼毒大戟可以通過抑制AGE-RAGE信號通路來減輕肝硬化大鼠的炎癥反應和纖維化程度。本研究為治療肝硬化提供了新的藥物及研究思路。但肝硬化是大多數肝病末期,其治療較為困難,因此,狼毒大戟對肝硬化的臨床應用還有待進一步深入研究。