地佐辛對多發性腦梗死大鼠星形膠質細胞活性及TLR4/NF-κB信號通路的影響

高文勇 吳瓊瑩 艾艷萍 李姣 魏海棠

(武漢市漢口醫院 1神經內科,湖北 武漢 430012;2康復醫學科)

多發性腦梗死(MCI)是指腦內有多個因缺血而產生的軟化病死灶,又稱為多發性腦軟化,可導致患者產生癱瘓、語言障礙、認知障礙、癡呆等不良癥狀,對患者的生命安全及生活質量造成不良影響,膠質細胞、神經細胞等腦組織內的炎癥反應是腦梗死期間腦損傷的主要原因之一〔1,2〕。星形膠質細胞是中樞神經系統中主要的大膠質細胞,對腦發育及神經功能至關重要,腦梗死時星形膠質細胞會發生細胞變性、增殖增強等一系列的病理反應,進而加劇腦損傷〔3,4〕。Toll樣受體(TLR)4是天然免疫受體,可激活核轉錄因子(NF)-κB通路,誘導腫瘤壞死因子(TNF)-α等炎癥因子的表達,在腦缺血再灌注大鼠炎癥反應中發揮促進作用〔5,6〕。因此探究具有抑制星形膠質細胞活性、腦組織炎癥反應的藥物對于治療MCI具有積極作用。地佐辛是一種阿片受體激動、拮抗劑,主要用于術后鎮痛、消炎等,對乳腺癌改良術后炎癥介質、應激反應具有一定的抑制作用〔7〕,對局灶性腦缺血再灌注大鼠神經功能、腦損傷等具有一定的保護作用〔8〕,對大鼠皮層星形膠質細胞活性及遷移能力具有一定的抑制作用〔9〕,因此本研究通過探究地佐辛對MCI大鼠星形膠質細胞活性及TLR4/NF-κB通路的影響。

1 資料與方法

1.1動物 40只SD雄性大鼠(北京維通利華實驗動物技術有限公司),SPF級,生產許可證號為SCXK(京)2016-0011,體質量250～300 g。所有大鼠于武漢市漢口醫院動物房中飼養,12 h晝夜交替,自由飲食、飲水,溫度約25 ℃,相對濕度約50%,保持動物房環境及鼠籠清潔、透氣。在實驗過程中按照動物使用的“3R”原則給予人道主義關懷。本研究經動物倫理委員會批準同意。

1.2主要試劑及儀器 地佐辛、尼莫地平(CAS號:53648-55-8、66085-59-4)購于上海源葉生物科技有限公司;海藻酸鈉微球血管栓塞劑(北京圣醫耀科技發展有限責任公司);大鼠TNF-α、白細胞介素(IL)-1β、IL-6酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(貨號:ml002859、ml037361、ml102828)購于上海酶聯生物科技有限公司;蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒、RIPA組織裂解液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白試劑盒(貨號:G1120、R0020、PC0020)購于北京索萊寶科技有限公司;兔源神經膠質纖維酸性蛋白(GFAP)、TLR4、髓樣分化因子(MyD)88、NF-κB、β-actin抗體(貨號:ab7260、ab217274、ab219413、ab220803、ab8227)購于Abcam公司;低溫高速離心機(美國Sigma公司);包埋機、切片機、染色機、封片機(德國Leica公司);正置熒光顯微鏡、光學顯微鏡(日本OLYMPUS公司);恒溫水浴箱(上海博訊有限公司);酶標儀(美國Thermo公司);蛋白電泳儀、轉膜儀(美國Bio-Rad公司)。

1.3動物模型制備及分組給藥 50只SD大鼠隨機分為假手術組(8只)、MCI造模組(32只),MCI大鼠模型的構建參考文獻〔10〕中的微球法,將大鼠持仰臥位固定,腹腔注射3.5%的水合氯醛麻醉大鼠,頸部皮膚常規消毒,于頸部正中做切口,暴露并分離頸總動脈、頸內動脈、頸外動脈,結扎大鼠頸外動脈遠心端,夾閉頸總動脈,用注射器由外動脈向內動脈注射0.1 ml的海藻酸鈉微球血管栓塞劑,使栓塞劑由動脈到達腦內動脈,形成多發性腦梗死,松開動脈夾,結扎頸外動脈近心端,縫合傷口回籠飼養,假手術組由0.1 ml的0.9%氯化鈉注射液代替栓塞劑,其余操作相同。大鼠蘇醒后對其進行神經功能缺損評分,分數為1～3分認為MCI大鼠造模成功。造模期間出現大鼠死亡或不符合條件的現象,及時選取備用大鼠進行MCI模型的構建。

將造模成功的MCI大鼠隨機分為模型組、地佐辛低劑量組(尾靜脈注射地佐辛,5 mg/kg)、地佐辛高劑量組(尾靜脈注射地佐辛,10 mg/kg)〔8〕、尼莫地平組(尾靜脈注射尼莫地平2 mg/kg)〔11〕,每組8只,按照各組給藥劑量進行給藥處理,連續14 d。

1.4各組神經功能缺損評分 在給藥第0、7、14天進行神經功能缺損評分,評分標準參考〔12〕,0分:無神經功能缺損癥狀,1分:不能完全伸展左側前爪等輕微神經功能缺損癥狀,2分:向一側轉圈等中度神經功能缺損癥狀,3分:向一側傾倒等重度神經功能缺損癥狀,4分:完全不能行走、意識障礙。

1.5各組腦組織HE染色觀察 將大鼠麻醉處死后取腦組織,每組取3只大鼠腦組織,修剪合適后于組織脫水機中脫水透明處理,將處理過的腦組織包埋于融化的石蠟中,待其凝固后切成厚約4 μm的切片,60 ℃烤片后采用HE染色試劑盒對大鼠腦組織進行HE染色處理,具體操作參考試劑盒中的說明書,封片后于顯微鏡下觀察。

1.6各組大鼠腦組織中星形膠質細胞活性測定 星形膠質細胞超微結構觀察:取1.5中剩余大鼠腦梗死組織適量(體積約為1 mm3),于4%戊二醛中固定1 h,經磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后用鋨酸固定2.5 h,用PBS清洗,經梯度乙醇脫水處理,用環氧樹脂包埋后切成厚度約為60 nm的薄片,經檸檬酸鉛、醋酸鈾染色后電鏡下觀察星形膠質細胞形態。

免疫組化法檢測星形膠質細胞標志物GFAP活性:取大鼠腦組織常規石蠟切片,60 ℃烘片6 h,經滴度乙醇脫蠟至水,用檸檬酸鹽緩沖液進行抗原修復,用PBS沖洗3次后滴加10%血清進行封閉處理,加入兔源GFAP抗體,4 ℃過夜,37 ℃復溫,加入羊抗兔二抗,經過二氨基聯苯胺(DAB)顯色、PBS沖洗后封片、觀察。

1.7各組腦組織中炎癥因子水平測定 取剩余5只大鼠腦組織適量,加入適量生理鹽水用勻漿機制成腦組織勻漿,離心取上清液,根據TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA試劑盒說明書進行炎癥因子水平的測定。

1.8各組腦組織TLR4/NF-κB通路相關蛋白表達檢測 取大鼠腦組織適量,用RIPA組織裂解液提取腦組織中總蛋白質,離心取上清液,用BCA試劑盒測定其中蛋白質水平,將腦組織用蛋白上樣液調至相同濃度,高溫加熱變性,采用電泳實驗分離蛋白,將分離的蛋白經濕轉法轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,加入8%的脫脂奶扥封閉處理,分別加入兔源TLR4(1∶200)、MyD88(1∶200)、NF-κB(1∶200)、β-actin(1∶5 000)一抗,4 ℃過夜,用TBST漂洗3次,加入辣根過氧化物酶標記的相應二抗,室溫孵育1 h,經過顯色、定影后觀察并分析。

1.9統計學分析 采用GraphPad Prism8軟件進行方差分析,兩組間比較行LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1各組神經功能缺損評分比較 給藥第0、7、14天,與假手術組相比,其余各組神經功能缺損評分顯著升高(P<0.05);給藥第7、14天,與模型組相比,地佐辛各劑量組及尼莫地平組神經功能缺損評分顯著降低(P<0.05),且有一定的劑量依賴效應,與地佐辛各劑量組相比,尼莫地平組神經功能缺損評分明顯降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組不同給藥時間神經功能缺損評分分)

2.2各組腦組織 假手術組腦組織無明顯病變,形態基本正常,神經細胞結構清晰,核仁核膜等結構基本正常;模型組腦組織病變明顯,神經細胞排列疏松,出現嚴重腫脹、空泡化等現象;與模型組相比,地佐辛各劑量組及尼莫地平組腦組織神經細胞結構得到一定緩解,其中尼莫地平效果較好。見圖1。

圖1 各組腦組織(HE染色,×200)

2.3各組腦組織星形膠質細胞超微結構及GFAP活性測定 假手術組腦組織中星形膠質細胞結構正常,細胞器正常,腦組織中GFAP蛋白表達(0.23±0.03)顯著較低;與假手術組相比,模型組腦組織中星形膠質細胞結構異常,出現嚴重腫脹、細胞核染色加深等不良表現,腦組織中GFAP蛋白表達(0.67±0.06)顯著升高(P<0.05);與模型組相比,地佐辛低、高劑量組、尼莫地平組腦組織中星形膠質細胞結構得到一定緩解,腦組織中GFAP蛋白表達(0.29±0.04、0.23±0.03、0.11±0.02)顯著降低(P<0.05),其中尼莫地平效果較好。見圖2、圖3。

圖3 各組腦組織GFAP蛋白表達(免疫組化染色,×200)

2.4各組腦組織炎癥因子水平比較 與假手術組相比,模型組、地佐辛低、高劑量組、尼莫地平組腦組織中TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著升高(P<0.05);與模型組相比,地佐辛各劑量組大鼠腦組織中TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著降低(P<0.05),且呈現一定的劑量效應關系;與地佐辛各劑量組相比,尼莫地平組腦組織中TNF-α、IL-1β、IL-6水平明顯降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組腦組織炎癥因子水平及TLR4/NF-κB通路蛋白表達比較

2.5各組腦組織TLR4/NF-κB通路蛋白表達比較 與假手術組相比,模型組、地佐辛低、高劑量組、尼莫地平組腦組織中TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達顯著升高(P<0.05);與模型組相比,地佐辛各劑量組腦組織中TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達顯著降低(P<0.05),且呈現一定的劑量效應關系;與地佐辛各劑量組相比,尼莫地平組腦組織中TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達明顯降低(P<0.05)。見表2、圖4。

1～5:正常對照組、模型組、地佐辛低劑量組、地佐辛高劑量組、尼莫地平組圖4 各組腦組織TLR4/NF-κB通路蛋白表達

3 討 論

MCI與動脈粥樣硬化、動脈狹窄動脈硬化斑塊脫落等多種疾病密切相關,具有較高的致殘率及復發率,嚴重影響患者生活質量〔13〕。腦缺血后炎癥反應是加劇神經功能、腦細胞受損的重要病理環節之一,腦壞死區域TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性因子釋放、白細胞浸潤、小膠質細胞及星形膠質細胞異常激活均可促進機體炎癥反應,加劇腦損傷〔14,15〕。

地佐辛常用于各大手術后的鎮痛,同時具有控制術后炎癥反應及氧化應激反應等作用〔16〕,對于腦缺血再灌注大鼠腦損傷、神經元損傷、神經功能缺損具有一定的保護作用〔8,17〕。本研究結果提示,地佐辛具有顯著改善MCI大鼠腦損傷及神經功能的作用,但其可能作用機制仍不清晰。

腦梗死后腦組織缺血壞死,腦內血管內皮細胞嚴重受損,受損部位會產生大量的炎性細胞因子,炎性細胞的聚集及浸潤將會增加缺血區腦組織的損傷,進而造成不可逆的神經功能受損〔18〕。星形膠質細胞是中樞神經系統重要的膠質細胞,腦梗死后腦部炎癥反應引起星形膠質細胞的異常激活,導致星形膠質細胞增殖能力增強、細胞肥大,活化的星形膠質細胞又會誘導小膠質細胞分化與增殖并促進TNF-α、IL-1β等炎癥因子的大量釋放,進而影響神經元突觸重建及生長,加劇腦損傷〔19〕。GFAP是星形膠質細胞特異性標志物,測定腦組織中GFAP蛋白的表達可側面反映星形膠質細胞活性〔20〕。TLR4/NF-κB通路是重要的炎癥反應通路,在腦缺血再灌注損傷中發揮重要作用,TLR4是重要的天然免疫受體,MyD88為TLR4通路重要的銜接分子,腦損傷后TLR4可誘導NF-κB激活,進而促進腦組織炎癥因子釋放,從而加劇腦損傷,抑制TLR4/NF-κB通路的激活對于抑制腦缺血再灌注損傷大鼠炎癥反應、改善神經功能具有積極的促進作用〔21～23〕。本研究結果提示,地佐辛可顯著降低MCI大鼠腦部炎癥反應及星形膠質細胞活性,對TLR4/NF-κB通路具有一定的抑制作用。