桔梗葉綠體比較基因組學分析及系統發育研究

張 瑜，杜晨暉，詹海仙，尚彩玲，李瑞鋒，原淑佳

桔梗葉綠體比較基因組學分析及系統發育研究

張 瑜，杜晨暉*，詹海仙，尚彩玲，李瑞鋒，原淑佳

山西中醫藥大學中藥與食品工程學院，山西 晉中 030619

以桔梗為材料，分析其葉綠體基因組特征，探究不同地區桔梗葉綠體基因組的差異及桔梗科其他物種的系統發育關系。利用 Illumina NovaSeq測序平臺對桔梗葉綠體全基因組進行測序，完成其組裝、注釋和特征分析，采用生物信息學方法對不同地區桔梗進行比較基因組分析和系統發育分析。桔梗葉綠體基因組全長172 770 bp，呈現典型的環狀四分體結構，總GC含量為38.10%，注釋到139個基因，其中蛋白質編碼基因95個，核糖體RNA 8個和轉運RNA 36個。經序列分析鑒定出139個SSR位點，大部分重復由A和T組成。該葉綠體基因組密碼子偏好性A/U大于G/C。邊界分析表明，不同地區桔梗的JLA邊界區域存在差異。對比不同地區桔梗葉綠體基因組序列發現21個變異區間，包括、、和等編碼區以及、和等非編碼區?；谧畲笏迫环ǎ╩aximum likelihood method，ML）對桔梗及其他17種桔梗科植物進行系統發育分析，發現桔?？莆锓N形成一個單系群，各屬物種聚為一束，支持率達100%。桔?？莆锓N聚為一支與傳統相符合，不同地區桔梗葉綠體基因組序列存在顯著差異，為后期開展分子鑒定及群體遺傳學研究提供提供科學依據。

桔梗；葉綠體基因組；序列比對；系統發育；SSR

藥用植物桔梗(Jacq.) A. DC.隸屬于桔?？平酃?，為多年生草本，別名包袱花、鈴當花、道拉基[1]。在《中國藥典》2020年版中桔梗以根入藥，具有宣肺利咽、祛痰排膿等功效，多用于咳嗽痰多、胸悶不暢、咽痛音啞、肺癰吐膿[2]。桔梗的主要化學成分為含桔梗皂甙，此外含有豐富的多糖、各種氨基酸及礦物質等，國家衛生部將桔梗列為藥食兩用的中藥材[3]。桔?？朴?0～70個屬，中國產16個屬，而桔梗屬僅有1個種桔梗[4]。桔梗產自東北、華北、華東、華中各省，韓國、朝鮮、日本等地區也有分布[5]。山西省陽泉市盂縣山地面積廣，海拔高，土壤中富含磷鉀，為桔梗的生長提供了得天獨厚的自然環境。桔梗作為山西盂縣地道中藥材，因其品質好被百姓譽為“小人參”。目前，藥用植物桔梗的葉綠體基因組雖然已經報道[6]，但是對于不同地區桔梗的葉綠體基因組組裝、基因組特征和系統進化分析等未見報道。

葉綠體基因組一般由1個大單拷貝區域（large single copy，LSC）、1個短單拷貝區域（small singlecopy，SSC）和2個反向重復區域（inverte drepeat，IR）組成閉環雙鏈DNA結構，基因組大小多為150～200 kb[7-9]。葉綠體是植物細胞內半自主性的細胞器，擁有相對獨立的基因組，依賴于母系遺傳，具有結構穩定、序列保守、間隔區變異位點豐富，分子進化速率慢等特點，廣泛應用于親緣關系、系統進化關系及遺傳多樣性研究[10-12]。

隨著測序技術的不斷發展以及測序成本的降低，已報道多種重要的藥用植物葉綠體基因組序列，如人參C. A. Meyer[13]、銀杏L.[14]、厚樸(Rehder & E. H. Wilson) N. H. Xia & C. Y. Wu[15]、紅豆杉var. chinensis (Pilger) Florin[16]、肉蓯蓉Ma[17]、三七(Burkill) F. H. Chen ex C. Y. Wu & K. M. Feng[18]、石斛Lindl.[19]、丹參Bunge[20]等。本研究基于高通量測序技術，對桔梗開展葉綠體全基因組測序、組裝及注釋，獲得其葉綠體基因組的全長序列信息；利用生物信息學手段比較分析不同地區桔梗的結構特征、簡單重復序列（simple sequence repeats，SSRs）位點、邊界分析、序列變異程度等，同時構建系統進化樹，為深入研究桔梗的鑒定、分子標記開發及系統發育關系提供數據支撐。

1 材料

桔梗新鮮葉片材料采自山西省陽泉市盂縣桔梗種植基地（38°13′55″E，113°6′16″N），憑證標本號為XZ-2020-1。葉片裝入取樣袋帶回實驗室，液氮速凍后放于?80 ℃冰箱保存備用。樣品由山西中醫藥大學杜晨暉教授鑒定，憑證標本存放于山西中醫藥大學標本館。桔梗及其近緣物種葉綠體基因組序列來源于NCBI數據庫，實驗材料詳細信息見表1。

表1 植物樣品來源

2 方法

2.1 提取DNA及測序

采用北京天根生化植物DNA提取試劑盒（Tiangen Biotech有限公司，中國）提取葉片DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳和微量分光光度計（Nanodrop 2000,美國）檢測DNA質量及濃度。以1 μg DNA起始量建庫，隨機打斷檢測合格的基因組總DNA，構建長度約350 bp的插入片段文庫。構建好的文庫經過質檢后，利用lllumina NovaSeq平臺進行雙末端測序，序列讀長為150 bp，測序工作由北京上鋒基因生物科技有限公司完成。

2.2 序列拼接、注釋及繪制物理圖譜

利用Trimmomatic軟件[21]對測序得到的原始序列（raw reads）進行質控（參數設置選擇默認值），濾過去除接頭（adapter）和低質量序列（reads），得到高質量待分析序列（clean reads）。參考序列為桔梗（NC_035624），運用NOVOPlasty軟件[22]對桔梗葉綠體基因組組裝，并利用GapCloser軟件對組裝結果進行內洞修補。然后使用CPGAVAS軟件[23]進行葉綠體基因組注釋，并運用Apollo軟件對注釋結果進行人工校準，最終結果提交至GenBank獲得登錄號（MZ202358）。運用Organellar Genome DRAW在線軟件[24]繪制桔梗葉綠體基因組物理圖譜。

2.3 簡單重復序列分析

利用MISA軟件檢測桔梗葉綠體基因組的SSRs[25]，參數設置為：單核苷酸重復單元≥10，二核苷酸重復單元≥5，三核苷酸和四核苷酸重復單元≥4，四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復單元≥3，且2個SSRs之間的最小距離為100 bp。

2.4 密碼子偏好性分析

使用CodonW軟件[26]（http://codonw. sourceforge.net/）獲得桔梗葉綠體基因組的有效密碼子數（effective number of codon，ENC）、密碼子的第3個堿基出現G/C的概率（GC3s）、相對同義密碼子使用度（relative synonymous codon usage， RSCU）。以ENC值為參考，對桔梗葉綠體基因組編碼序列從大到小排序，篩選最高和最低兩端各10%的基因，分別建立高、低表達基因庫，以ΔRSCU（高表達基因RSCU－低表達基因RSCU）≥0.08為條件，篩選出高表達密碼子；以RSCU＞1為條件，篩選出高頻密碼子。同時滿足高頻和高表達條件的密碼子確定為最優密碼子[27]。

2.5 葉綠體基因組IR邊界的收縮和擴張分析

IR區域相對保守，IR邊界的膨脹和收縮被認為是被子植物葉綠體全基因組大小變化的主要機制[28]。本研究使用IRscope在線軟件（https://ir-scope. shinyapps.io/irapp/）獲得并比較分析桔梗及桔?？破渌?種植物葉綠體基因組的IRA/IRB、LSC和SSC和邊界基因的序列長度，探討桔梗科植物葉綠體基因組IR邊界的收縮和擴張特征[29]。

2.6 葉綠體基因組序列變異分析

本研究基于LAGAN模型，利用mVISTA軟件對中國地區桔梗（MZ202358）與韓國地區桔梗（NC_035624）葉綠體全基因組進行序列比對和變異分析[30]。

2.7 系統發育分析

從GenBank獲取紫莖澤蘭（NC_036222）、展枝沙參（NC_036221）、薄葉薺苨（NC_026999）等桔?？?7種（19個）物種和2個外類群物種的完整葉綠體基因組信息，分析獲得66個共有蛋白質編碼基因：、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、。利用在線軟件MAFFT7（https://mafft. cbrc.jp/alignment/ server/）將上述物種的共有編碼基因進行比對，比對結果使用IQ-TREE multicore 2.0.5（http:// www.iqtree.org/）軟件[31]，最大似然法（maximum likelihood method，ML）構建系統發育樹，構樹參數設置：-mMFP- B1000-alrt 1000，優構樹模型：GTR+F+R3，Bootstrap value為1000。

3 結果與分析

3.1 葉綠體基因組的基本特征

與大多數被子植物相同，桔梗的葉綠體基因組呈現典型的四分體結構，由2個大小相同、方向相反的反向重復區（IRa、IRb）、1個LSC區和1個SSC區組成（圖1）。桔梗的葉綠體基因總長度為172 770 bp，其中LSC區長79 115 bp，SSC區長7841 bp，IRa區長42 907 bp，IRb區長42 907 bp。桔梗葉綠體基因組整體GC含量為38.10%，其中蛋白編碼區的GC含量是38.11%，4個區段中GC含量最高的是IR區（39.53%），其次是LSC區（37.25%）和SSC區（31.03%）。

桔梗葉綠體基因組共注釋到139個基因，包括95個蛋白編碼基因、36個tRNA基因和8個rRNA基因（表2）。蛋白編碼基因的長度為90 594 bp，占整個基因組長度的52.44%；tRNA基因的長度為2713 bp，占總長度的1.57%；rRNA基因的長度為9176 bp，占總長度的5.31%。非編碼區主要包括內含子、假基因（、、、等）和基因間隔區，占整個基因組長度的40.68%。在桔梗葉綠體基因組注釋到4個具有內含子的基因，包括、、、。

圖1 桔梗葉綠體基因組物理圖譜

表2 桔梗葉綠體基因組注釋信息

3.2 密碼子的偏好性

桔梗葉綠體基因組的密碼子使用偏性中，葉綠體基因組的ENC值為51.24，明顯高于35，表明密碼子偏好性較弱。GC3s含量為28.61%，表明密碼子第3位偏好于A和U結尾。通過最優密碼子分析顯示（表3），有30個密碼子RSCU＞1，25個密碼子ΔRSCU≥0.08，篩選發現同時滿足這2個條件的最優密碼子有9個，分別為UUG、AUU、UCA、AGC、CCU、GCU、CAU、CGU和GAU，其中以A/U結尾的有7個，以C/G結尾的有2個。

表3 桔梗葉綠體基因組最優密碼子

下劃線表示RSCU＞1；*表示該密碼子ΔRSCU≥0.08，**表示ΔRSCU≥0.3，***表示ΔRSCU≥0.5；加粗標注的密碼子為最優密碼子

The underline indicates RSCU > 1;*represents the codon ΔRSCU ≥ 0.08,**represents ΔRSCU ≥ 0.3, and***represents ΔRSCU ≥ 0.5; The codons highlighted in bold are the optimal codons

3.3 SSR位點分析

共檢測到桔梗葉綠體基因組139個SSR位點，包括115個單核苷酸重復序列、6個二核苷酸重復序列、5個三核苷酸重復序列、11個四核苷酸重復序列和2個六核苷酸重復序列。其中，60個SSR位于基因間隔區（IGS），65個SSR位于外顯子（exon），14個SSR位于內含子（intron）。葉綠體不同區域的SSR分布情況見圖2，大部分SSR位于LSC和IRs區域內，只有少數位于SSC區域內。SSR中重復占比最大的是單核苷酸，約82.73%，而二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸和六核苷酸則占比減小，分別占4.32%、3.60%、7.91%和1.44%。桔梗葉綠體基因組中的SSR主要是有A和T組成的，占所有重復序列的83.45%，其中A/T堿基構成的單核苷酸重復108條，AT/AT組成的二核苷酸重復序列5條，ATT/TAA組成的三核苷酸重復序列2條，AAAT組成的四核苷酸重復序列1條。

圖2 桔梗葉綠體基因組中SSR位點類型及數量

桔梗科5種植物葉綠體基因組序列中，總共檢測到SSR位點103～143個SSR位點（表4），其中單核苷酸重復為90～117個、二核苷酸重復為6～8個、三核苷酸重復5～14個、四核苷酸重復1～11個、五核苷酸重復0～4個、六核苷酸重復0～2個。這些SSR主要分布于葉綠體基因組的LSC區（36.70%～65.12%），編碼基因序列中分布的SSR數量僅占總數的32.56%～54.37%。

3.4 桔梗及桔梗科部分物種葉綠體全基因組特征比較

桔?？撇糠种参锶~綠體全基因組特征的比較分析見表5，桔梗及其近緣種物種共5種（6個）植物葉綠體基因組的序列長度范圍為159 759～172 770 bp，其中沙參的葉綠體基因組長度最短，而桔梗的葉綠體基因組最長，不同地區的桔梗葉綠體基因組長度相差952 bp。6個物種葉綠體基因組總GC含量為38.10%～39.03%，IR區的GC含量（39.53%～51.00%）均顯著高于LSC區（36.86%～38.18%）和SSC區（31.03%～35.42%）。其中桔梗的GC含量最低，銅錘玉帶草的GC含量最高。不同地區桔梗全基因組的總GC含量相差不大，分別是38.10%和38.12%。

利用Geneious 11.0.3軟件獲取桔梗及4種近緣桔?？浦参锏腎R 區、LSC區和SSC區序列。結果表明，IR區的序列長度范圍為20 200～85 814 bp，其中沙參的IR區最短，桔梗的IR區最長，不同地區桔梗的IR區的長度相差948 bp。LSC區序列長度范圍為79 061～112 321 bp，其中桔梗的LSC區長度最短（79 061 bp），沙參LSC區長度最長（112 321 bp），不同地區的桔梗LSC區的長度相差54 bp。SSC區序列長度范圍介于7840～27 238 bp，其中沙參的SSC區最長（27 238 bp），桔梗的SSC區最短（7840 bp），不同地區桔梗的SSC區的長度僅相差1 bp。

表4 桔?？莆锓N葉綠體基因組中SSR信息統計

表5 桔梗科植物葉綠體全基因組基本特征

3.5 桔梗及桔梗科部分物種的葉綠體基因組邊界分析

桔梗及桔?？?個屬共5種植物葉綠體基因組的IR-LSC和IR-SSC邊界比較顯示（圖3），桔梗與其余4種桔?？浦参锶~綠體全基因組相比，邊界處基因不完全相同，基因的長度也有差異。LSC/IRb 邊界（JLB）邊界擴張范圍顯示，桔梗與其余4種桔梗科植物相比，JLB邊界側翼基因為和基因，而銅錘玉帶草、毛細鐘花和小黨參JLB邊界處具有相同的基因，左翼為基因，右翼為基因，但擴張程度稍有差異，沙參的JLB邊界位于基因左翼。SSC/IRb（JSB）邊界擴張范圍顯示，桔梗、毛細鐘花與銅錘玉帶草JSB邊界位于基因，但擴張程度不同。小黨參JSB邊界位于基因的右翼，距離1 bp，而沙參JSB邊界位于基因的左翼。SSC/IRa（JSA）邊界擴張范圍顯示，桔梗和小黨參JSA邊界位于基因內，但擴張程度稍有差異。毛細鐘花和銅錘玉帶草JSB邊界位于基因右翼，距離分別為273、139 bp，而沙參JSB邊界位于基因右翼。LSC/IRa（JLA）邊界擴張范圍顯示，桔梗與其余4種桔?？浦参颙LA邊界位于基因左翼，但擴張程度有差異。不同地區的桔梗其邊界具有高度的保守性，各邊界側翼基因完全相同，擴張程度略有差異。

3.6 葉綠體基因組序列變異分析

本研究測序的桔梗植物葉綠體基因組與韓國地區桔梗全基因組序列相似性比較結果見圖4。結果表明，2種不同地區桔梗葉綠體基因組序列的整體相似度較高，但仍存在明顯的差異。變異程度最高的區域集中在IR區，編碼區和非編碼區都有不同程度的變異。、、、等基因的編碼區存在7個單堿基突變（SNP），基因的編碼區有2個插入突變。非編碼區存在7個單堿基突變和5個插入突變，包括、、等，如新測序桔梗在基因間隔區108 704 bp處插入255個堿基。這些變異位點是不同地區桔梗鑒定的潛在分子標記，具有極高的研究價值。

圖3 桔梗科物種葉綠體基因組邊界序列差異

A-桔梗（MZ202358） B-桔梗（NC_035624）

3.7 系統進化分析

本研究以桔梗、2個外類群和已公布的17種（18個）桔?？浦参锏?6個共有蛋白編碼基因進行比對，將比對結果采用IQ-TREE軟件ML法構建系統進化樹（圖5）。結果顯示，19個桔梗科物種構成一單系分支，顯著區分于外類群擬南芥和人參，具有100%支持率。在系統樹上，桔梗科物種可以分為3個主要分支。A分支是半邊蓮亞科構成的單系分支，支持率為100%。B分支和C分支由桔梗亞科構成，支持率為100%。分支C包括2個族，桔梗族和藍鐘花族。不同地區的桔梗聚為一小支，進一步與黨參屬、藍鐘花屬、細鐘花屬物種聚為一支。分支B是風鈴草族構成的構成的單系分支，支持率為100%。基于葉綠體基因組的系統進化樹與已知的物種進化關系一致，為桔?？莆锓N系統進化關系的建立提供依據。

圖5 基于66個蛋白編碼基因構建的ML樹

4 討論

桔梗始載于《神農本草經》，是中醫常用的一味止咳平喘的良藥。本研究完成了桔梗葉綠體基因組的測序、組裝和注釋。結果表明，桔梗葉綠體基因組具有被子植物葉綠體基因組典型的四分體結構，包括1個LSC區、1對IR區和1個SSC區，序列長172 770 bp，其長度高于其他4個近緣種。不同地區桔梗葉綠體基因序列長度在171 800～172 800 bp，IR區的差異最大（952 bp)，原因是本研究測序的桔梗位于IR區的基因存在明顯的序列插入現象，導致其比已報道的韓國地區桔梗序列長。桔梗葉綠體基因組GC含量低于其他４個近緣種。不同地區桔梗葉綠體基因組GC含量基本一致（38.10%～38.12%），IR區的GC含量均高于其他區域，可能與IR區含有高GC含量的rRNA基因有關。不同地區桔梗葉綠體基因組分別注釋到139和140個基因，包括95個蛋白編碼基因、36～37個tRNA基因和8個rRNA基因，體現了葉綠體基因組的穩定性。

植物葉綠體基因組中IR區域的收縮和擴張是一種相對普遍的現象，使相同植物群體之間的整個葉綠體基因組之間出現差異[32]。本研究中桔梗與其他4個近緣種IR邊界分析顯示，其LSC/IRb邊界（JLB）、SSC/IRb邊界（JSB）、SSC/IRa邊界（JSA）和LSC/IRa邊界（JLA）的側翼基因類型和擴張程度有明顯差異，對研究物種進化等具有重要意義。不同地區桔梗葉綠體基因組邊界基因和擴張程度完全相同，僅JLA邊界與側翼基因trnH的距離相差2 bp。本研究中桔梗葉綠體基因組SSR位點有139個，以單核苷酸重復（占總數的83.40%）為主要類型，且隨著拷貝數目增加，SSRs數量明顯減少，這種現象在其它植物中也有報道[33]。桔梗葉綠體基因組中的SSR主要分布于LSC和IR區，多數由堿基A和T組成，與石斛屬部分物種的SSR堿基組成相似[34]。不同地區桔梗的核苷酸重復類型基本相同，但SSR的數量有差異，原因是IR區的SSR數量存在差異。桔?？撇煌瑢俚奈锓N葉綠體基因組中的SSR的數量和分布模式差異顯著，這些SSRs為桔梗科物種鑒定和系統發育分析奠定基礎。

已有研究表明，葉綠體基因組常應用于物種鑒定和系統發育關系研究[10-12]。比對2個不同地區的桔梗葉綠體基因組序列編碼區和非編碼區都有不同程度的變異，、、、等基因的編碼區和、、等基因間隔區存在14個單堿基突變和7個插入缺失突變，基于21個差異區可開發特異DNA條形碼，鑒定不同地區的桔梗，為優化種質資源及良種繁育奠定基礎。

為進一步界定藥用植物桔梗在桔?？频南到y位置，探討桔梗屬與其近緣屬的系統發育關系?；诮酃？?9個物種66個共有編碼基因構建系統發育樹結果顯示，所有的桔梗科物種形成一個單系群，支持率為100%。桔梗族物種與藍鐘花族物種聚為一組，該結果與Li等[34]的研究結果類似。不同地區的桔梗聚為一小支，進一步與黨參屬、藍鐘花屬、細鐘花屬物種聚為一支，說明桔梗屬、黨參屬、藍鐘花屬、細鐘花屬親緣關系較近。有學者認為銅錘玉帶屬與半邊蓮屬有密切的親緣關系，應合并為半邊蓮屬[10]。銅錘玉帶草原隸屬于銅錘玉帶屬，但目前《中國植物志》已修訂銅錘玉帶草為半邊蓮屬[35]。圖5顯示銅錘玉帶草與其他半邊蓮屬物種互為姐妹群，支持“半邊蓮屬與銅錘玉帶屬應合并成為半邊蓮屬”的說法[10]。本研究中桔梗科系統進化樹與已知的物種進化關系一致。

本研究對桔梗葉綠體基因組重新測序，綜合分析桔梗的葉綠體基因組序列、結構和特征，篩選出不同地區桔梗葉綠體基因組的差異序列，探討桔?？莆锓N系統進化關系，結果不僅豐富了桔梗的葉綠體基因組信息，為葉綠體基因組序列中篩選特異性DNA條形碼基因序列及系統發育關系研究提供了參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Comparative and phylogeny analysis ofcomplete chloroplast genomes

ZHANG Yu, DU Chen-hui, ZHAN Hai-xian, SHANG Cai-ling, LI Rui-feng, YUAN Shu-jia

College of Traditional Chinese Medicine and Food Engineering, Shanxi University of Chinese Medicine College, Jinzhong 030619, China

To explore the differences of chloroplast genomes of Jiegeng [(Jacq.) A. DC.] from different regions and phylogenetic relationship betweenit and its relatives, the complete chloroplast genome ofwas sequenced and assembled.We sequenced the chloroplast genome ofusing Illumina NovaSeq sequencing platform, and assembled, annotated and characterized them, compared the chloroplast genomes sequences using bioinformatics methods, and analyzed the phylogenetic relationships.The full chloroplast genome ofwas 172 770 bp in length and its GC content was 38.10%, with a typical circular tetrad structure. A total of 139 genes were annotated, including 95 protein-coding genes, 8 rRNA genes, and 36 tRNA genes. A total of 139 SSRs were detected, most of which consisted of A and T. The codon preference of A/U was greater than that of G/C. The comparison of boundary region showed that there were differences in inverted repeat region (IR) of two different regions of. Analyses of sequences from the two different regions ofshowed that 21 diverse regions are found in the protein coding regions such as,,,,and in the intergenic regions such as,,. Based on the maximum likelihood method (ML) for phylogenetic analysis ofand 17 other Campanulaceae plants, it was found that Campanulaceae species formed a single monophyletic group. The clustering of plants of the same genus was in line, and the support rate reached 100%.The clustering of Campanulaceae species was in line with tradition. There were significant differences in chloroplast genome sequence ofamong different regions. These results will provide an important basis for the further development of molecular identification and population genetics.

(Jacq.) A. DC.; complete chloroplast genome; sequence alignment; phylogenetic analysis; SSR

R286.12

A

0253 - 2670(2023)15 - 4981 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.15.023

2023-03-10

基于基因組學的“盂桔梗”道地性研究（SZY-YQZX-2019006）；山西省應用基礎研究計劃項目（201901D211540）；山西道地藥材品質形成機制創新團隊（2022TD2009）；山西中醫藥大學中藥資源學（2023XKJS-23）

張 瑜（1982—），女，講師，研究方向為中藥資源與開發。E-mail: 15364887652@163.com

通信作者：杜晨暉，教授，碩士生導師，研究方向為中藥鑒定學。E-mail: dch@sxtcm.edu.cn

[責任編輯 時圣明]