基于轉錄組測序揭示光質對刺五加實生苗基因表達的調控作用

張 爽，王謙博，郭盛磊，王振月*

? 藥材與資源?

基于轉錄組測序揭示光質對刺五加實生苗基因表達的調控作用

張 爽1，王謙博2，郭盛磊3，王振月3*

1. 貴州中醫藥大學，貴州 貴陽 550000 2. 廣東藥科大學附屬第一醫院，廣東 廣州 510000 3. 黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040

目的 對刺五加實生苗進行轉錄組測序，分析其響應不同光質調控的分子機制。方法 以生長60 d的刺五加實生苗為材料，設置不同光質處理組（LED-1、LED-2）和對照組 [高壓鈉燈（high pressure sodium，HPS）]，應用Illumina HiSeqTM對其葉片進行轉錄組測序，對測序后的結果進行基因功能注釋、差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs）篩選和共表達網絡分析。結果 轉錄組測序共獲得126 252條Unigene。其中92 681條被注釋，3個處理組中篩選出DEGs 7664個。基因本體（gene ontology，GO）富集結果表明，DEGs在代謝過程、刺激響應、細胞結構、催化活性等功能中得到顯著富集。京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）途徑富集分析表明，DEGs顯著富集在植物激素傳導、糖代謝、苯丙烷類生物合成、類黃酮生物合成。適度光質脅迫可以促進刺五加實生苗中苯丙素類化合物生物合成途徑關鍵酶基因的表達，是促進刺五加有效成分累積的基礎。結論 通過高通量轉錄組測序，揭示了不同光質對刺五加實生苗基因表達的調控特征，可為深入研究刺五加藥效成分的生物合成機制及栽培中的光環境設置提供科學依據。

刺五加；光質；轉錄組測序；差異表達基因；轉錄因子

刺五加(Rupr. Maxim.) Harms為五加科多年生植物，以干燥根和根莖或莖入藥，具有益氣健脾、補腎安神等傳統功效，于脾肺氣虛、體虛乏力、食欲不振、肺腎兩虛，久咳虛喘、腎虛腰膝酸痛、心脾不足、失眠多夢等癥[1-2]。刺五加是我國傳統大宗藥材，藥用歷史悠久且市場需求量大，目前以人工栽培為主[3]。研究發現，適度的光脅迫不僅能促進刺五加生長，對刺五加中次生代謝產物的累積具有顯著影響，但過多的光干預不利于植株的生長[4-5]。因此在刺五加的栽培過程中，通過合理的光質配比控制藥材的產量和質量顯得尤為重要。近年來隨著高通量轉錄組測序技術的快速發展，通過比較多個樣本間的差異表達基因，來探討植物響應環境脅迫的分子機制已成為目前研究的熱點[6-8]。光脅迫對植物形態結構、生理和生化反應的影響已有深入研究，但對次生代謝調控機制的研究還較少[9-10]。本研究以刺五加為材料，分別設置對照組和適度光質處理組，利用轉錄組測序和差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs）分析和實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術，分析不同光質培養的刺五加幼苗轉錄組水平的變化，以期在從基因表達水平上揭示光質對刺五加幼苗生長發育影響的分子調控機制。

1 材料與儀器

1.1 材料

刺五加實生苗所用種子采自于黑龍江省七臺河市（45°37′ N，31°15′ E），經黑龍江中醫藥大學王振月教授鑒定為刺五加(Rupr. Maxim.) Harms。

1.2 儀器

LED可控光質照射燈，長春智倫圃道農業科技有限公司；HPS型高壓鈉燈，湖州歐迪照明有限公司；Total RNA Extractor（Trizol），上海生工有限公司；Qubit2.0 RNA檢測試劑盒，Life公司；Qubit2.0 DNA檢測試劑盒，Life公司；4S Red Plus核酸染色劑，BBI Life Science公司；第一鏈cDNA合成試劑盒EP0733，Thermo Scientific?公司；SG Fast qPCR Master Mix（2×），BBI Life Science公司；VAHTSTM mRNA-seq V2 Library Prep Kit for Illumina?，南京諾唯贊公司；VAHTSTM DNA Clean Beads，南京諾唯贊公司；Q32866 Qubit 2.0熒光計，Invitrogen公司；WH-3 微型漩渦混合儀，上海滬西分析儀器廠有限公司；Thermo Scientific Sorvall Legend Micro21R臺式高速低溫離心機，Thermo公司；Cycler T100? Thermal PCR儀，BIO-RAD公司；DYY-11電泳儀，北京市六一儀器廠；H6-1型微型電泳槽，上海精益有機玻璃制品儀器廠；FR-980A型生物電泳圖像分析系統，復日科技；SW-CJ-1D型潔凈工作臺，江蘇蘇潔凈化設備廠；SMA4000型微量分光光度計，Merinton公司；StepOne型熒光定量PCR儀，ABI公司。

2 方法

2.1 樣品處理

試驗在該溫室中進行，4月選取生長勢一致的種苗移植于將其播種于以草炭土和珍珠巖的混合物為的栽培基質（3∶1，pH≈6.0）直徑12 cm的營養缽中，每盆1株刺五加幼苗。為充分利用光照且互不遮蔽，將12個盆間隔構放置在一個托盤中，采用低水位灌溉自吸式供水；定植10 d后，將所有盆隨機排列并放入3個操控架中，每個操控架設置不同光質的培養光源，進行不同光質處理。光質處理分別為LED-1、LED-2和對照光源高壓鈉燈（high pressure sodium，HPS），測得HPS燈的R/G/B的光合光子通量密度（PPFD）比為43.7∶54.6∶1.7；因此，LED-1處理用適當增加了藍光配比的光譜（R/G/B，43.8∶47∶9.2）。LED-2處理增強了R光比（R/G/B，74.3∶12.5∶13.2）。每個操控架的所有內部空間被設置為16 h光周期，照明周期為5:00 am～21:00 pm。在整個實驗中，監測相對濕度（RH）和溫度分別為（70±10）%和25 ℃/18 ℃（白天/夜晚）。移動苗床上方55 cm處的PPFD為（94±5）μmol/(m2·s)。處理60 d后，分別采收對照組和光質處理的刺五加葉，洗凈后用液氮速凍，置于?80 ℃保存備用。

2.2 總RNA的提取與轉錄組測序

取刺五加葉在液氮中研成粉末，用Total RNA Extractor（Trizol）提取試劑盒進行總RNA提取，并用Qubit 2.0檢測RNA濃度，瓊脂糖凝膠檢測RNA完整性以及基因組污染情況。每處理3份生物學重復。將每處理3份樣品等量混合，委托上海生工有限公司構建測序文庫，并使用Illumina HiSeqTM測序平臺進行轉錄組測序。

2.3 測序數據組裝及Unigene功能注釋

對原始測序數據進行濾過，去除測序接頭、引物以及低質量的序列后，獲得高質量的clean reads。使用Trinity軟件將clean reads組裝成contig，利用De Bruijn進一步簡化后獲得Unigene。然后使用BLAST軟件將Unigene序列與Non-Redundant Protein Sequence Database（NR）、Swiss-Prot、基因本體（gene ontology，GO）、clusters of orthologous groups （）、真核生物蛋白相鄰類的聚簇（Clusters of orthologous groups for eukaryotic complete genomes，KOG）、京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）數據庫比對，獲得Unigene的注釋信息。

2.4 DEGs分析

使用FPKM（fragments per kilobase oftranscript per million mapped reads）計算Unigene的表達量，利用EBseq平臺篩選葉中的DEGs基因，篩選條件為值≤0.05且差異倍數（fold change，FC）≥1.5。并對篩選出的DEGs進行GO、KEGG富集分析。

2.5 qRT-PCR驗證

采用qRT-PCR的方法對刺五加生長和苯丙素類成分合成途徑中的5個關鍵酶基因，在不同光質作用下對Daucus carota、PETH、GRH1、PAL3、GH31的PCR擴增引物設計見表1。qRT-PCR為20 μL反應體系，包括cDNA模板2 μL、上游引物0.4 μL、下游引物0.4 μL、SybrGreen qPCR Master Mix 10 μL、ddH2O 7.2 μL。檢測、、、共4個皂苷合成相關酶基因的表達量，以在各處理組和對照組中表達比較穩定的管家基因作為內參基因，每個樣品進行3個技術重復。基因表達量以HPS對照組的基因的表達量為1，采用2?ΔΔCt法計算。

表1 qRT-PCR引物

3 結果與分析

3.1 測序數據與基因注釋

過濾原始數據后，各樣品的30堿基百分比在95%以上，且GC含量均在50%左右。將clean reads進行組裝共得到126 252條Unigene，Unigene的50為812，其中長度在1 kb以上的Unigene有17 932條。通過選擇BLAST參數值≤1×10?5和HMMER參數值≤1×10?10，最終獲得92 681個有注釋信息的Unigene，約占Unigene總數的73.41%。Unigene與NCBI和NT數據庫進行blastn比對，取值≤1×10?10并且相似度＞90%，coverage＞80%的比對結果，計算其物種分布，進行污染檢測，目前刺五加全基因組測序尚未完成，NT數據庫中刺五加的堿基序列有限，雖未比對到刺五加，但比對到的eads遠遠小于總reads數，足以說明本實驗所有樣品未受到其他物種污染。但HPS和LED-1所有樣品的首位比對結果都是人參C. A. Mey.排在第1位，而LED-2處理組樣品均是西洋參L.排在第1位，且前10位中HPS與LED-1品種相近，而與LED-2差別較大，表明不同處理方式對基因的注釋信息具有一定影響。

3.2 Unigene總體差異分析

為了解光質對刺五加生理代謝影響的分子機制，采用DESeq進行分析研究2種光質培育刺五加幼苗與對照組間的顯著性差異基因，將篩選的條件設定為∣FC∣＞1.5且值＜0.05。從3個處理中篩選得到7664個DEGs。與HPS對照組相比，LED-1組中篩選出3699個DEGs，其中2549個上調基因和1150個下調基因，LED-2組中篩選出2428個DEGs，1662個上調基因和766個下調基因，LED-1與LED-2相比篩選出1537個DEGs，893個上調基因和644個下調基因。將不同組樣品中基因的差異倍數變化值繪制在橫軸上，并將基因表達量值的變化的統計學顯著性繪制在縱軸上。圖1結果宏觀顯示，LED-1和LED-2組雖然差異基因少，但表達差異倍數較大，而HPS與LED-1組的表達差異倍數小，但是差異顯著。

3.3 差異基因功能注釋

為了闡釋3種處理間差異基因的功能信息，根據GO、KOG和KEGG數據庫進行注釋。圖2顯示了DEG的GO分類結果，其總結為3類：生物過程，細胞組分和分子功能。在這些類別中，“細胞凋亡”“膜質體”“共質體”“營養庫活性”“核酸結合轉錄因子活性”和“結合體”在各差異間均表現顯著。其中“共質體”“核酸結合轉錄因子活性”和“電子載荷活性”呈顯著減少趨勢，“節律過程”、“抗氧化活性”和“營養庫活性”被增加顯著富集。此外，LED-1LED-2、HPSLED-2和HPSLED-1分別有484、939和1686個DEGs被注釋于22個KOG分類中（圖3）。在KOG中，“翻譯后修飾和分子伴侶蛋白質周轉”占最大比例，其次是“細胞壁、膜、包膜生物發生”和“次生代謝物生物合成、運輸和分解代謝”，然而“細胞遷移”在LED-1LED-2和HPSLED-2之間沒有響應基因。為了鑒定轉錄組中代表的潛在生物途徑。將KEGG用于進一步分析。結果顯示，LED-1 vs LED-2中有733個DEGs分配到189個KEGG途徑，其中在“氧化磷酸化”“內質網中的蛋白質加工”和“核糖體”途徑中顯著富集。在HPSLED-1中，有1078個差異基因被注釋在220個KEGG途徑，其中在“氧化磷酸化”“氨基酸的生物合成”和“碳水化合物代謝”途徑中顯著富集。在HPSLED-1中，有1865個DEGs注釋于248個KEGG途徑，其中在“苯丙烷類生物合成”“植物-病原體相互作用”“植物激素信號轉導”和“核糖體”顯著富集。

a-HPS vs LED-1中DEGs b-HPS vs LED-2中DEGs c-LED-1 vs LED-2中DEGs 圖中的每個點代表一個基因，其中紅色表示上調基因，綠色表示下調基因，黑色表示非差異基因

3.4 DEGs功能富集分析

為了提高2種光質對刺五加生長影響研究可靠性，識別出生物現象最相關生物學途徑，采用超幾何分布對基因富集分析，找出2種光質處理后與HPS對照組相比較，表達水平有差異的基因集。結果表明，與HPS對照組相比，LED-1光質處理組苗具有值＜0.05的顯著差異性基因集共392個，其中上調基因集273，下調基因集119個，在這些基因集所標注中可以看出，LED-1顯著促進了刺五加細胞壁組織、細胞基質的合成過程，為刺五加生長提供了物質基礎，而且，LED-1處理還促進了激素接到和激素傳遞等反應功能基因，并顯著提高了細胞對激素表達刺激的基因表達，證明其有效促進了刺五加實生苗體內激素含量，具體激素類型可結合KEGG激素相關合成通路進行分析；LED-2光質處理組苗具有值＜0.05的顯著差異性基因集共201個，其中上調基因集152個，下調基因集59個，LED-2光質與LED-1光質促進的基因集具有顯著差異，LED-2光質似乎更有刺激刺五加實生苗光合系統的發育，其對葉綠體、類囊體的基因集具有顯著影響，LED-2對于次生代謝產物具有非常顯著的基因集提高，但由于LED-2光質的光能較強，對于刺五加實生苗具有一定的刺激作用，從顯著的基因集中可以看出，其顯著提高了應激性防御基因集的表達。根據顯著富集的功能最高的前30個DEGs集繪制散點圖，見圖4。

3.5 光質對刺五加實生苗生長代謝相關通路影響

為深入探究2種光質模式對刺五加苗生長影響機制，分別將2處理組與HPS對照組的差異基因進行生長和營養代謝相關通路富集，研究發現LED-1處理光質對植物激素傳導、糖代謝和類固醇生物合成等9條與生長相關通路有影響，其中4條具有顯著性影響；LED-2處理對植物激素傳導等7條與生長相關通路產生影響，但僅對植物激素方向具有顯著性影響，通路名稱、注釋差異基因個數及顯著性見表2。

a-HPS vs LED-1 DEGs b-HPS vs LED-2 DEGs c-LED-1 vs LED-2 DEGs

3.6 光質對刺五加實生苗次生代謝產物相關通路影響

為了深入了解2種生產模式光質對于刺五加苗次生代謝影響，分別將2處理組與HPS對照組的差異基因進行次生代謝相關通路富集，通路名稱、注釋差異基因個數及顯著性見表3。結果表明，2種光質種植模式對于苯丙烷類生物合成、苯丙氨酸代謝和類黃酮生物合成均有極顯著的影響，而這3條途徑包括刺五加絕大多數的藥效成分。此外，LED-2光質對于刺五加苗的次生代謝產物萜類合成，尤其是倍半萜類和三萜類化合物的生物合成具有顯著影響。

A-HPS/LED-1 DEGs B-HPS/LED-2 DEGs C-LED-1/LED-2 DEGs

a-HPS/LED-1 DEGs b-HPS/LED-2 DEGs 縱坐標代表功能注釋信息，橫坐標表示對應的rich factor，q值大小由點顏色表示，顏色越深，q值越小，每個功能下包含的DEG多少用點大小表示

表2 不同處理與HPS對照組生長代謝顯著差異通路

3.7 qRT-PCR驗證基因表達

為驗證轉錄組數據中差異表達基因的可靠性，選取了刺五加生長發育和苯丙氨酸類合成途徑相關途徑的3個關鍵酶基因進行qRT-PCR分析。結果如表4、5所示，根據2種光質不同處理中所選定的3條代謝相關途徑，可以看出LED-1光質處理對于植物生理生長和苯丙氨酸類合成途徑中的GRH1和PAL3與HPS對照組相比在刺五加苗體內極顯著表達，LED-2處理組促生長和苯丙氨酸類化合物合成的相關基因GH31和PAL3表達量顯著高于HPS對照組。這些基因qRT-PCR研究結果與轉錄組分析結果一致。

表3 不同光質處理組與HPS對照組次生代謝相關顯著差異基因表達通路

表4 LED-1處理組與HPS對照組關鍵基因qRT-PCR結果

表5 LED-2處理組與HPS對照組關鍵基因qRT-PCR結果

4 討論

光質對植物的生長和生理代謝至關重要，它不僅作為能量來源直接影響植物的光合作用，還是一種影響植物光形態建成和體內物質代謝活動主要觸發信號[11]。近年來，LED燈光和不同顏色的濾光膜常被研究者用來探究光質對植物生長和次生代謝物質積累的影響。相對于濾光膜，LED燈光有著光譜波段更加精密的優點，備受學者們關注[12]。本研究通過比較其豐度和相關基因上調顯著性和差異性，在分子機制研究過程中發現，LED-1光照處理對于刺五加生長和發育在分子水平表現出主要促進生理機制發生和激素水平，進而促進的刺五加苗的快速生長；而LED-2對于刺五加生長則有刺激性，雖然株高增長更快，但是卻是一種類似于刺激性生長；這一點除了在次生代謝相關途徑差別印證，與LED-1光質處理組差異基因注釋通路明顯不同，LED-2光質處理對于刺五加苗生長過程中，有多種應激性的促生長調節方式反饋。LED-2光質處理作為刺五加苗生長過程中一種環境脅迫，使得刺五加幼苗產生了一系列的防衛反應，有相當數量涉及到PPAR信號通路、TGF-β信號通路、Ras信號通路、PI3K-Akt信號通路”等應激性反應生物學過程的unigene得到了差異表達。與此同時，涉及過氧物應激系統、鈣離子、茉莉酸和苯丙氨酸等信號轉導過程的unigene差異表達也非常顯著。因此，基于轉錄組學和qRT-PCR的研究結果，認為LED-2光質影響刺五加苗的代謝輪廓是主要是通過這些信號轉導基因的差異表達促使轉錄因子等基因表達水平發生變化，而PAL3作為PAL基因家族成員是參與苯丙烷代謝途徑的重要酶，是生物合成苯丙烷類天然產物的第1步，而且可以參與植物色素的形成。本實驗不同處理對于PAL3的表達量均有顯著影響，且LED-1中表達量顯著高于LED-2處理，這也印證了光質對于植物的刺激反應和激發植物體內“防御基因”，進而促進次生代謝產物的合成。

刺五加作為世界重要的藥用植物，國內外研究者對其物質基礎、藥理活性及其藥效學等方面展開了廣泛而深入的研究。目前已有學者對于刺五加有效成分合成的關鍵基因進行克隆研究，但是目前還未見刺五加整個基因組信息公布，公共數據庫可獲得的刺五加基因組信息非常有限。因此，本實驗通過基于Illumina HiseqTM測序平臺，對刺五加葉轉錄組進行深度測序和de-novo組裝，獲得的unigene，與NR、SWISS-PROT等公共數據庫進行比對和注釋，建立了刺五加功能基因數據庫。同時，對不同光質照射處理下的刺五加unigene的表達情況進行了深度分析，從中篩選出主要涉及信號轉導、植物激素調控、糖代謝等生物學過程的差異表達unigene。本研究通過高通量轉錄組測序，初步揭示了光質改變對刺五加基因表達的調控特征，對其中一些關鍵基因和轉錄因子進行深入研究，可為刺五加藥效成分的生物合成機制以及在大田生產育苗中的合理優化光環境提供科學依據。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Sequencing and analysis of transcriptome to reveal regulation of gene expression inseedling under light quality

ZHANG Shuang1, WANG Qian-bo2, GUO Sheng-lei3, WANG Zhen-yue3

1. Guizhou University of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550000, China 2. The First Affiliated Hospital/School of Clinical Medicine of Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510000, China 3. Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China

To analyze the molecular mechanism of different tissues of Ciwujia ()seedlingin response to light quality by transcriptome sequencing.The seedlings of 60 dfrom moderate light quality group and control group (LED-1, LED-2) were used as the test material. And the transcriptome sequencing analysis was carried out by using Illumina HiSeqTM. After obtaining transcriptome data, gene function annotation, differentially expressed genes (DEGs) screening and and co-expression network analysis were performed.A total of 126 252 unigenes were obtained by transcriptome sequencing. Among them, 92 681 unigenes were annotated, and 7664 DEGs were screened out from three treatment groups. The GO enrichment results showed that the DEGs of the roots and leaves were both significantly enriched in metabolic process, stimulus response, cell structure, catalytic activity and other functions. The KEGG pathway enrichment analysis showed that DEGs in leaves were mainly concentrated in phytohormone transduction, sugar metabolism, phenylpropanoid biosynthesis, and flavonoid biosynthesis. Moderate light quality stress can promote the expression of key enzyme genes of phenylpropanoid biosynthesis pathway inseedlings, which is the basis for promoting the accumulation of effective components of.The high-throughput transcriptome sequencing revealed the regulatory characteristics of light quality stress on gene expression in different tissues of, which could provide scientific basis for further research on the biosynthesis mechanism of medicinal components ofand reasonable luminous environment in cultivation.

(Rupr. et Maxim.) Harms; light quality; transcriptome sequencing; differentially expressed genes; transcription factors

R286.12

A

0253 - 2670(2023)15 - 4973 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.15.022

2023-02-03

“十三五”國家重點研發計劃（2016YFC0500303）

張 爽（1991—），女，漢族，博士，講師，研究方向為中藥資源與栽培方向。E-mail: rocmsw@163.com

通信作者：王振月，男，教授，從事中藥資源研究方向。E-mail: wangzhen_yue@163.com

[責任編輯 時圣明]