密點麻蜥不同部位調(diào)控NF-κB/SNAIL通路干預(yù)胃癌順鉑耐藥研究

程翻娥，白 星，李 錚，師小茜，李衛(wèi)強, 2*

密點麻蜥不同部位調(diào)控NF-κB/SNAIL通路干預(yù)胃癌順鉑耐藥研究

程翻娥1，白 星1，李 錚1，師小茜1，李衛(wèi)強1, 2*

1. 寧夏醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，寧夏 銀川 750004 2. 寧夏少數(shù)民族醫(yī)藥現(xiàn)代化教育部重點實驗室，寧夏 銀川 750004

基于核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）/SNAIL通路探討密點麻蜥不同部位聯(lián)合順鉑（cisplatin，DDP）對胃癌裸鼠順鉑耐藥模型的干預(yù)機制。將36只BALB/c裸鼠于右側(cè)腋窩sc MKN45/DDP細(xì)胞懸液制備胃癌裸鼠耐藥模型，造模成功后隨機分為模型組、DDP組、密點麻蜥頭部＋DDP組、四肢＋DDP組、軀干＋DDP組和尾部＋DDP組，每組6只。除模型組外，其余各組給予相應(yīng)藥物治療4周。MTT法檢測MKN45/DDP細(xì)胞的耐藥性；檢測各組腫瘤體積及抑瘤率；蘇木素-伊紅（HE）染色觀察各組腫瘤組織病理變化；免疫組化法檢測各組腫瘤組織黏蛋白1（Mucin 1，MUC1）表達(dá)；Western blotting檢測各組腫瘤組織中NF-κB/SNAIL通路相關(guān)蛋白、E-鈣黏附蛋白（E-cadherin）及P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）、多藥耐藥蛋白1（multidrug resistance-associated protein 1，MRP1）、肺耐藥蛋白（lung resistant protein，LRP）表達(dá)；TUNEL檢測各組腫瘤組織細(xì)胞凋亡情況。與MKN45細(xì)胞相比，MKN45/DDP細(xì)胞對順鉑的耐藥性相對較強，其半數(shù)抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50）和耐藥指數(shù)分別為0.671 μg/mL、1.973。與模型組比較，各給藥組腫瘤體積均顯著縮小（＜0.05），以尾部＋DDP組抑瘤率最高；腫瘤細(xì)胞排列稀疏，細(xì)胞核呈不同程度縮小或破裂；腫瘤組織p-p65、SNAIL、P-gp、MRP1、LRP和MUC1蛋白表達(dá)水平均顯著降低（＜0.05、0.01），E-cadherin蛋白表達(dá)水平均顯著升高（＜0.05、0.01），細(xì)胞凋亡率均顯著升高（＜0.05、0.01），以尾部＋DDP組最為明顯。密點麻蜥不同部位聯(lián)合DDP可調(diào)控NF-κB/SNAIL通路，逆轉(zhuǎn)荷瘤裸鼠胃癌順鉑耐藥，以尾部＋DDP組增敏提效作用最佳。

密點麻蜥；順鉑；胃癌；耐藥性；NF-κB/SNAIL通路；尾部

胃癌是全球發(fā)病率位居第5位、死亡率位居第4位的消化道惡性腫瘤，其5年存活率僅為25%～30%[1]?；熓悄壳爸委熚赴┑闹饕椒ǎ绕鋵τ谥型砥诨颊叨?，化療幾乎是延長生命的唯一方式，但化療耐藥是治療的主要障礙[2]。因此，探索逆轉(zhuǎn)胃癌耐藥的藥物已成為當(dāng)前臨床研究的熱點問題，中藥在改善化療藥物耐藥方面有明顯優(yōu)勢、療效確切，尤其是增敏提效更為明顯[3]。密點麻蜥Günther以沙地生存為主，有活血化瘀、消癭散結(jié)、利尿通淋、鎮(zhèn)靜之功[4]。課題組前期結(jié)合濰坊醫(yī)學(xué)院應(yīng)用密點麻蜥同類無蹼壁虎身體不同部位抗癌研究的啟示下，對沙地密點麻蜥（人工養(yǎng)殖）進行了全體及身體分部位抗癌研究，發(fā)現(xiàn)密點麻蜥不同部位可通過抑制沉默調(diào)節(jié)蛋白1（Sirtuin 1，SIRT1），誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮抗癌作用，其中以密點麻蜥尾部作用最明顯[5]；密點麻蜥可能通過降低SNAIL蛋白表達(dá)，增加E-鈣黏附蛋白（E-cadherin）蛋白表達(dá)，降低N-cadherin蛋白表達(dá)，來抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）發(fā)展進程，發(fā)揮對胃癌肝轉(zhuǎn)移的抑制作用[6]?；诖?，本研究進一步探究寧夏密點麻蜥不同部位通過調(diào)控核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）/SNAIL通路對荷瘤裸鼠胃癌順鉑化療耐藥的干預(yù)作用。

1 材料

1.1 動物與細(xì)胞

SPF級BALB/c雄性裸鼠36只，4～6周齡，體質(zhì)量（20±2）g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，合格證號SCXK（京）2021-0006。裸鼠飼養(yǎng)于寧夏醫(yī)科大學(xué)動物中心，自由進食飲水，溫度（22±3）℃，相對濕度（50±10）%，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后進行實驗。動物實驗經(jīng)寧夏醫(yī)科大學(xué)倫理審查委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號IACUC-NYLAC-2022-109）。人胃癌MKN45細(xì)胞、人胃癌順鉑耐藥株（MKN45/DDP）購自浙江美森細(xì)胞科技有限公司。

1.2 藥材

密點麻蜥（批號2208036）購自寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院門診，經(jīng)寧夏醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院劉艷華教授鑒定為密點麻蜥Günther。

1.3 藥品與試劑

順鉑（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.9%，批號124L021）、中性樹膠（批號622G021）、胎牛血清（批號2222092）購自北京索萊寶科技有限公司；MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒（批號KGA311-KGA312）購自武漢博士德生物工程有限公司；蘇木素-伊紅（HE）染色液（批號CR2107043）、P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）單克隆抗體（批號GB113291）、肺耐藥蛋白（lung resistant protein，LRP）單克隆抗體（批號GB112334）、HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體（批號GB23303）、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG抗體（批號GB25301）、黏蛋白1（Mucin 1，MUC1）多克隆抗體（批號GB114938）購自武漢賽維爾生物科技公司；全蛋白提取試劑盒（批號20220823）購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)液（批號2230182）、青鏈霉素混合液（批號20220705）購自上海達(dá)特希爾生物科技有限公司；NF-κB p65單克隆抗體、磷酸化NF-κB p65（phosphorylated NF-κB p65，p-NF-κB p65）多克隆抗體、E-cadherin多克隆抗體、SNAIL多克隆抗體、兔抗鼠β-actin多克隆抗體（批號分別為AF5006、AF2006、AF0131、AF6032、AF7018）購自江蘇親科生物研究中心有限公司；多藥耐藥蛋白1（multidrug resistance-associated protein 1，MRP1）多克隆抗體（批號GTX116046）購自深圳欣博盛生物科技有限公司；無蛋白快速封閉液（批號03661200）購自上海雅酶生物科技有限公司。

1.4 儀器

311型細(xì)胞培養(yǎng)箱、EVOSTMXL core細(xì)胞成像系統(tǒng)倒置生物顯微鏡（美國Thermo Fisher Scientific公司）；CKX53型熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；TP1020型全自動組織脫水機、RM2255型全自動輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機、HI1210型烤片機、HI1220型攤片機、Aperio LV1型切片掃描儀（德國Leica公司）；JXFSTPRP-CL型冷凍研磨機（上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司）；A-14C型高速冷凍離心機、Amersham Imager 680RGB型超靈敏多功能成像儀（美國GE公司）；Mini Protean Tetra蛋白電泳系統(tǒng)（美國伯樂公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

MKN45/DDP細(xì)胞用RPMI 1640完全培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)基中加入0.1 μg/mL順鉑以維持其耐藥性，造模前2周換無順鉑的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，每2～3天換液1次，待細(xì)胞生長至對數(shù)生長期，用于后續(xù)實驗。

2.2 MTT檢測MKN45/DDP細(xì)胞對順鉑的耐藥性

MKN45、MKN45/DDP細(xì)胞分別以1×104個/mL接種于96孔板中，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。分別加入0、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 μg/mL順鉑處理細(xì)胞24 h，設(shè)置不含培養(yǎng)基不接種細(xì)胞的空白孔，棄去培養(yǎng)基，每孔加入50 μL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去上清液，每孔加入150 μL二甲基亞砜，輕微震蕩5 min使甲臢溶解，采用酶標(biāo)儀測定490 nm處的吸光度（）值，計算細(xì)胞存活率。采用Graphpad Prism 8軟件計算半數(shù)抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50）值，再通過IC50計算耐藥指數(shù)。

細(xì)胞存活率＝(實驗－空白)/(對照－空白)

耐藥指數(shù)＝MKN45/DDP細(xì)胞IC50/MKN45細(xì)胞IC50

2.3 動物造模、分組及給藥

參考文獻方法[7]制備裸鼠胃癌耐藥模型，取對數(shù)生長期的MKN45/DDP細(xì)胞（1×107個/mL），無菌條件下接種于裸鼠右前腋窩皮下（0.2 mL/只）。sc 1周后，所有裸鼠皮下均可摸到腫塊，表明造模成功。將36只裸鼠隨機分為模型組、順鉑（2 μg/kg）組、密點麻蜥頭部（2 g/kg）＋順鉑（2 μg/kg）組、密點麻蜥四肢（2 g/kg）＋順鉑（2 μg/kg）組、密點麻蜥軀干（2 g/kg）＋順鉑（2 μg/kg）組、密點麻蜥尾部（2 g/kg）＋順鉑（2 μg/kg）組，每組6只。待瘤體生長至長徑＞5 mm時開始給藥[8]，中藥給藥劑量參照臨床等效劑量（成人日用量與小鼠體表面積計算出裸鼠等效劑量[9]）。采用傳統(tǒng)煎藥方法將密點麻蜥身體不同部位分別置于1 L蒸餾水中煎煮2次，紗布濾過，合并藥液，根據(jù)前期預(yù)實驗結(jié)果濃縮至0.02 g/mL的水提液，4 ℃保存?zhèn)溆?。順鉑組參照文獻方法[10]，小鼠ip順鉑（2 μg/kg），2次/周，連續(xù)給藥8次；寧夏密點麻蜥頭部、四肢、軀干、尾部＋順鉑組小鼠分別ig頭部、四肢、軀干、尾部水提液，2次/d，持續(xù)28 d，同時ip順鉑（2 μg/kg），2次/周，連續(xù)給藥8次；模型組ig等體積生理鹽水，連續(xù)28 d。

2.4 腫瘤體積及抑瘤率測定

自首次給藥干預(yù)后每3天測量腫瘤長徑（）和短徑（），計算腫瘤體積[11]。末次給藥24 h后，處死全部裸鼠，完整剝離腫瘤組織，測量腫瘤體積，計算抑瘤率。

腫瘤體積＝2/2

抑瘤率＝(模型組平均腫瘤體積－給藥組平均腫瘤體積)/模型組平均腫瘤體積

2.5 各組裸鼠腫瘤組織病理變化觀察

末次給藥后處死全部裸鼠，完整剝離瘤組織，用4%多聚甲醛溶液固定24 h，流水沖洗12 h，分別置于75%、85%、95%、100%乙醇中脫水，二甲苯透明、浸蠟、包埋、切片、展片、撈片、烤片，經(jīng)蘇木素-伊紅（HE）染色、中性樹膠封片后，置于顯微鏡下觀察各組裸鼠腫瘤組織病理學(xué)變化。

2.6 免疫組化法檢測腫瘤組織MUC1表達(dá)

將各組腫瘤組織切片置于烘箱中1 h，常規(guī)脫蠟、水化、高壓抗原熱修復(fù)及封閉后，分別加入一抗、二抗孵育，DAB顯色、蘇木素復(fù)染、脫水封片后，顯微鏡下觀察并進行圖像采集，陽性結(jié)果表達(dá)呈棕色或棕黃色。依據(jù)陽性免疫反應(yīng)的圖像選取陽性表達(dá)區(qū)域，Image J軟件對上述陽性結(jié)果進行分析。

2.7 Western blotting檢測腫瘤組織p65、p-p65、SNAIL、E-cadherin、P-gp、MRP1和LRP蛋白表達(dá)

取各組腫瘤組織100 mg，加入裂解液，置冰上備用，加入研磨珠，放入冷凍研磨機中研磨，置于高速冷凍離心機中4 ℃離心10 min，取上清，用BCA蛋白含量試劑盒測定蛋白濃度，加入上樣緩沖液，混勻后沸水浴10 min使蛋白變性。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，經(jīng)快速封閉液搖床孵育15 min，加入一抗，4 ℃孵育過夜；次日復(fù)溫1 h，洗膜5次，每次5 min，加入二抗，室溫孵育2 h，洗膜后，加入ECL化學(xué)發(fā)光液曝光及圖像采集，用Image J軟件分析目的蛋白灰度。

2.8 TUNEL檢測腫瘤組織細(xì)胞凋亡情況

各組腫瘤組織切片常規(guī)脫蠟至水，加入蛋白酶K工作液37 ℃孵育20 min，漂洗3次；加入50 μL TUNEL反應(yīng)混合液，37 ℃避光孵育1 h，漂洗3次；加入DAPI染色液，室溫孵育20 min，漂洗3次；封片，用熒光顯微鏡觀察并拍照。凋亡細(xì)胞核為綠色熒光，DAPI染色細(xì)胞核為藍(lán)色熒光，用Image J軟件分析結(jié)果。

2.9 統(tǒng)計學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 MKN45/DDP細(xì)胞對順鉑的耐藥性

0、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 μg/mL順鉑分別作用于MKN45和MKN45/DDP細(xì)胞24 h后，如圖1所示，順鉑對MKN45和MKN45/DDP細(xì)胞增殖均有抑制作用，IC50分別為0.340、0.671 μg/mL，耐藥指數(shù)為1.973。與MKN45細(xì)胞相比，MKN45/DDP細(xì)胞對順鉑的耐藥性相對較強，敏感性降低。

3.2 密點麻蜥不同部位對裸鼠胃癌耐藥模型腫瘤體積和抑瘤率的影響

各組裸鼠腫瘤組織表面可見結(jié)節(jié)狀突起，呈圓形或類圓形，質(zhì)脆、硬，邊界清楚，部分腫瘤組織表面易破潰、出血。如圖2所示，與模型組比較，各給藥組腫瘤體積均顯著縮小（＜0.05）；與順鉑組比較，密點麻蜥不同部位＋順鉑組腫瘤體積均顯著縮?。ǎ?.05、0.01），其中尾部＋順鉑組腫瘤體積最小且抑瘤率最高，表明尾部＋順鉑組治療效果最佳。

圖1 不同質(zhì)量濃度的順鉑對MKN45和MKN45/DDP細(xì)胞存活率的影響

3.3 密點麻蜥不同部位對裸鼠胃癌耐藥模型腫瘤組織病理變化的影響

如圖3所示，模型組腫瘤細(xì)胞呈圓形、卵圓形或不規(guī)則形，連接緊密，細(xì)胞核大、深染、圓而均勻；各給藥組腫瘤細(xì)胞排列稀疏，大小不一，呈片狀壞死，細(xì)胞核出現(xiàn)不同程度縮小或破裂。

3.4 密點麻蜥不同部位對裸鼠胃癌耐藥模型腫瘤組織MUC1表達(dá)的影響

MUCI陽性表達(dá)大多在細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色或褐色顆粒狀。如圖4所示，與模型組比較，各給藥組MUC1蛋白陽性表達(dá)量均顯著減少（＜0.05、0.01）；與順鉑組比較，密點麻蜥不同部位＋順鉑組MUC1蛋白陽性表達(dá)量均顯著減少（＜0.05），其中尾部＋順鉑組MUC1蛋白陽性表達(dá)量最低。

與模型組比較：*P＜0.01 **P＜0.01；與順鉑組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01，下圖同

箭頭表示MUCI蛋白陽性表達(dá)

3.5 密點麻蜥不同部位對裸鼠胃癌耐藥模型腫瘤組織p65、p-p65、SNAIL、E-cadherin、P-gp、MRP1和LRP蛋白表達(dá)的影響

如圖5所示，與模型組比較，各給藥組腫瘤組織p-p65、SNAIL、P-gp和LRP蛋白表達(dá)水平均顯著降低（＜0.05、0.01），密點麻蜥不同部位＋順鉑組E-cadherin蛋白表達(dá)水平均顯著升高（＜0.05、0.01），MRP1蛋白表達(dá)水平均顯著降低（＜0.05、0.01）；與順鉑組比較，密點麻蜥不同部位＋順鉑組E-cadherin蛋白表達(dá)水平均顯著升高（＜0.05、0.01），四肢＋順鉑組、軀干＋順鉑組和尾部＋順鉑組p-p65、SNAIL、P-gp、MRP1和LRP蛋白表達(dá)水平均顯著降低（＜0.05、0.01），以尾部＋順鉑組上述蛋白表達(dá)變化最為明顯。各組p65蛋白表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異。

3.6 密點麻蜥不同部位對裸鼠胃癌耐藥模型腫瘤組織細(xì)胞凋亡的影響

如圖6所示，與模型組比較，各給藥組細(xì)胞凋亡率均顯著升高（＜0.05、0.01）；與順鉑組比較，密點麻蜥不同部位＋順鉑組細(xì)胞凋亡率均顯著升高（＜0.05），其中尾部＋順鉑組細(xì)胞凋亡率最高。

4 討論

胃癌是一種由幽門螺旋桿菌感染、飲食、遺傳、環(huán)境等多類因素引起的胃黏膜惡性病變，其發(fā)病率位居我國惡性腫瘤第3位，病死率位居第2位，且進展期胃癌有較高的轉(zhuǎn)移率和復(fù)發(fā)率，其5年生存率僅25%～30%[12]，極大威脅患者健康。因胃癌患者缺乏早期有效診斷方法，發(fā)現(xiàn)時多處于中晚期，已失去手術(shù)機會，故化療成為其主要的治療方式。順鉑是晚期和轉(zhuǎn)移性患者的重要化療藥物之一，多數(shù)患者早期可通過順鉑化療取得較好療效，但隨用藥時間延長會使順鉑對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性減低而產(chǎn)生耐藥性[13]，致臨床效果不佳。因此，順鉑耐藥性逆轉(zhuǎn)為臨床胃癌化療增敏提效的重要問題。探索逆轉(zhuǎn)胃癌化療耐藥、增敏提效的藥物具有重要的臨床意義和價值，特別是結(jié)合理論指導(dǎo)和臨床思維的中醫(yī)藥抗化療耐藥的療效及機制研究顯示出其重要性和迫切性，中西藥聯(lián)合應(yīng)用抑制胃癌化療耐藥是當(dāng)前臨床腫瘤研究的焦點[10]。

圖5 密點麻蜥不同部位對裸鼠胃癌耐藥模型腫瘤組織p65、p-p65、SNAIL、E-cadherin、P-gp、MRP1和LRP蛋白表達(dá)的影響(, n = 6)

圖6 密點麻蜥不同部位對裸鼠胃癌耐藥模型腫瘤組織細(xì)胞凋亡的影響(, n = 6)

寧夏密點麻蜥是蜥蜴科動物麗斑麻蜥屬，生活于荒漠中，以干燥全體入藥[14]，為寧夏地區(qū)道地藥材之一，其味咸、寒，歸肺、肝、腎經(jīng)，具有活血化瘀、消癭散結(jié)、利尿通淋、鎮(zhèn)靜之功效[4]。研究發(fā)現(xiàn)，密點麻蜥富含蛋白質(zhì)、氨基酸、硒等微量元素，可提高機體免疫力，有較好的抗癌作用，其尾部再生力強，對身體有良好保護和功能修復(fù)作用[14-15]。課題組前期研究表明，密點麻蜥不同部位含藥血清可有效抑制胃癌細(xì)胞增殖，具有良好的抗癌作用，以尾部抗腫瘤作用最強[5,16]。本研究發(fā)現(xiàn)，密點麻蜥不同部位聯(lián)合順鉑均有不同程度逆轉(zhuǎn)胃癌順鉑耐藥的作用，并誘導(dǎo)耐藥細(xì)胞凋亡，以尾部＋順鉑組效果最為明顯。表明密點麻蜥聯(lián)合順鉑可不同程度增強胃癌細(xì)胞對順鉑的敏感性，逆轉(zhuǎn)化療耐藥。

NF-κB/SNAIL信號通路與腫瘤化療耐藥密切相關(guān)。NF-κB是一種重要的核轉(zhuǎn)錄蛋白，在MDR1的第1個內(nèi)含子中確定了1個相同的NF-κB結(jié)合位點，并證實其復(fù)合物可與該內(nèi)含子位點相結(jié)合，形成耐藥[17]。NF-κB主要由核轉(zhuǎn)錄因子p65和p50構(gòu)成同源/異源二聚體，可協(xié)調(diào)各種基因表達(dá)，影響體內(nèi)細(xì)胞分化、凋亡和腫瘤生長等生物學(xué)功能，其中p65的磷酸化是NF-κB最關(guān)鍵的修飾方式之一[18-19]。SNAIL作為鋅指轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子SNAIL超家族中的成員，可誘導(dǎo)EMT，下調(diào)E-cadherin表達(dá)，參與腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移[20]。研究表明，SNAIL在胃癌、肝癌、結(jié)腸癌等組織高表達(dá)，并與組織學(xué)分級和腫瘤耐藥性密切相關(guān)[21-23]。本研究發(fā)現(xiàn)，荷瘤裸鼠胃癌順鉑耐藥后p-p65及SNAIL表達(dá)上調(diào)，E-cadherin表達(dá)下調(diào)；給予寧夏密點麻蜥不同部位聯(lián)合順鉑治療后，p-p65及SNAIL蛋白表達(dá)均有不同程度下調(diào)，E-cadherin蛋白表達(dá)均有不同程度上調(diào)，以尾部＋順鉑組上述蛋白表達(dá)變化最為明顯。上述結(jié)果表明寧夏密點麻蜥聯(lián)合順鉑可通過不同程度介導(dǎo)NF-κB/SNAIL信號通路，促使p-p65及SNAIL表達(dá)下調(diào)、E-cadherin表達(dá)上調(diào)，從而抑制EMT進程，進而逆轉(zhuǎn)胃癌順鉑耐藥。

P-gp、MRP1、LRP為跨膜轉(zhuǎn)運蛋白，可介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞對化療藥物的耐藥性，通過降低細(xì)胞內(nèi)化療藥物的濃度，抑制腫瘤細(xì)胞殺傷作用，還可使化療藥物從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)，使其無法到達(dá)靶點部位[24-25]。研究發(fā)現(xiàn)，P-gp、MRP1、LRP在癌組織中異常高表達(dá)可引起細(xì)胞內(nèi)化療藥物的濃度降低，達(dá)不到有效治療濃度，從而產(chǎn)生耐藥性[26]。MUC1是MUCIN家族一種關(guān)鍵黏蛋白，在多種上皮性腫瘤細(xì)胞中常過表達(dá)，能以不同形式上調(diào)三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白的表達(dá)，調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的炎癥細(xì)胞，促進腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，誘導(dǎo)化療耐藥[27-28]。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，密點麻蜥不同部位聯(lián)合順鉑組P-gp、MRP1、LRP及MUC1蛋白表達(dá)均有不同程度下調(diào)，以尾部＋DDP組上述蛋白表達(dá)下調(diào)最為明顯。證實寧夏密點麻蜥不同部位聯(lián)合順鉑可通過抑制P-gp、MRP1、LRP及MUC1表達(dá)，從而增強耐順鉑細(xì)胞對順鉑的敏感性，改善荷瘤裸鼠胃癌順鉑耐藥。

綜上，寧夏密點麻蜥不同部位聯(lián)合順鉑對胃癌順鉑耐藥裸鼠皮下瘤均有明顯抑制作用，可不同程度減小腫瘤體積，促進耐藥細(xì)胞凋亡，并調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白表達(dá)，從而改善胃癌裸鼠的化療耐藥性，增敏提效，以尾部＋順鉑組效果最為明顯。其機制可能為通過抑制NF-κB/SNAIL信號通路的激活，從而發(fā)揮逆轉(zhuǎn)胃癌順鉑耐藥的作用。另外，密點麻蜥提取和成分鑒定仍是一個難題。課題組前期與南京中醫(yī)藥大學(xué)段金廒教授合作對復(fù)方蜥蜴散在動物體內(nèi)的代謝產(chǎn)物進行初步鑒定，由于相關(guān)藥物研究較少且尚未查詢到可以做質(zhì)譜的對照品，具體成分仍未明確。目前課題組仍在進行密點麻蜥單味提取及成分鑒定工作。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Different parts ofon intervention of cisplatin resistance in gastric cancer by regulating NF-κB/SNAIL pathway

CHENG Fan-e1, BAI Xing1, LI Zheng1, SHI Xiao-qian1, LI Wei-qiang1, 2

1. Department of Traditional Chinese Medicine, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, China 2. Key Laboratory of Modernization of Hui Nationality Medicine, Ministry of Education, Yinchuan 750004, China

To explore the intervention mechanism of different parts ofcombined cisplatin (DDP) on cisplatin-resistant model of gastric cancer in nude mice based on nuclear factor-κB (NF-κB)/SNAIL pathway.Thirty-six BALB/c nude mice were subcutaneously injected with MKN45/DDP cells suspension in the right armpit to establish a drug-resistant model of gastric cancer. After successful modeling, mice were randomly divided into model group, DDP group, head + DDP group, limbs + DDP group, trunk + DDP group and tail + DDP group, with six mice in each group. Except the model group, the other groups were given corresponding drugs for four weeks. Drug resistance of MKN45/DDP cells were detected by MTT assay. The tumor volume and tumor inhibition rate of each group were detected. HE staining was used to observe the pathological changes of tumor tissues in each group. Immunohistochemical method was used to detect Mucin 1 (MUC1) expression in tumor tissues of each group. Western blotting was used to detect expressions of NF-κB/SNAIL pathway related proteins, E-cadherin, P-glycoprotein (P-gp), multidrug resistance-associated protein 1 (MRP1) and lung resistance protein (LRP) in tumor tissues of each group. TUNEL was used to detect the apoptosis of tumor tissue in each group.Compared with MKN45 cells, MKN45/DDP cells were relatively resistant to cisplatin, its half inhibitory concentration (IC50) and drug resistance index were 0.671 μg/mL and 1.973, respectively. Compared with model group, tumor volume in each group was significantly reduced (< 0.05), and the tumor inhibition rate in tail + DDP group was the highest. The tumor cells were sparsely arranged, and the nuclei were reduced or ruptured to varying degrees. The expressions of p-p65, SNAIL, P-gp, MRP1, LRP and MUC1 protein in tumor tissues were significantly decreased (< 0.05, 0.01), while E-cadherin protein expression was significantly increased (< 0.05, 0.01), and apoptosis rate was significantly increased (< 0.05, 0.01), tail + DDP group was the most obvious.The combination of different parts ofwith DDP can regulate NF-κB/SNAIL pathway and reverse cisplatin resistance of gastric cancer in nude mice bearing tumor, and tail + DDP group has the best sensitization effect.

Günther; cisplatin; gastric cancer; drug resistance; NF-κB/SNAIL pathway; tail

R285.5

A

0253 - 2670(2023)15 - 4920 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.15.017

2023-03-03

寧夏自然科學(xué)基金重點項目（2021AAC02014）；國家自然科學(xué)基金資助項目（82260916）

程翻娥（1994—），女，碩士研究生，從事肝病和脾胃病的基礎(chǔ)與臨床研究。Tel: (0951)6880501 E-mail: 642630031@qq.com

通信作者：李衛(wèi)強（1974—），男，教授，博士生導(dǎo)師，從事中醫(yī)藥治療脾胃病研究，國家中醫(yī)藥管理局第六批名老中醫(yī)師承項目繼承人。Tel: (0951)6880501 E-mail: lwq200309@163.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]