小桃兒七中2個新的甾體類化合物

李玉澤，張東東，姜 祎，鄧 翀，王 薇，劉建利，宋小妹*

? 化學成分 ?

小桃兒七中2個新的甾體類化合物

李玉澤1，張東東1，姜 祎1，鄧 翀1，王 薇1，劉建利2，宋小妹1*

1. 陜西中醫藥大學藥學院，陜西 咸陽 712046 2. 西北大學生命科學學院，陜西 西安 710069

研究小桃兒七中的甾體類成分及其細胞毒性。采用多種現代分離色譜技術進行分離純化，根據MS、IR和NMR等數據鑒定新化合物的結構，采用MTT法對新化合物的細胞毒活性進行篩選。從小桃兒七的正丁醇部位分離鑒定了2個甾體類化合物，分別鑒定為(25)-27--β--葡萄吡喃糖基-3,25-二羥基螺甾-5(6)-烯- 1β-yl--α--阿拉伯吡喃糖苷（1）和3β,14β-二羥基-3β-(2-羥基丙酰氧基)-5α-蟾酥甾-20,(22)-二烯（2），化合物2對人結腸癌HCT116細胞、人肺癌A549細胞和人肝癌HepG2細胞的半數抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50）分別為（10.8±0.4）、（4.8±0.7）、（45.3±1.8）μmol/L。化合物1和2均為新化合物，分別命名為鐵筷子苷M（thibetanoside M）和鐵筷子苷N（thibetanoside N）；化合物2表現出較好的細胞毒活性。

小桃兒七；甾體皂苷；強心苷；細胞毒性；鐵筷子苷M；鐵筷子苷N

小桃兒七是毛茛科鐵筷子屬植物鐵筷子Franch.的根及根莖，屬于秦巴特色草藥“太白七藥”之一。鐵筷子屬植物全世界約有20余種，其中鐵筷子為我國特產，分布于陜西、甘肅、湖北、四川等地，在陜西主要分布于秦嶺山南北坡，具有清熱解毒、活血散瘀、消腫止痛之功效，主要用于治療跌打損傷、尿道炎及瘡癤腫毒等[1]。

文獻研究表明小桃兒七的主要化學成分為強心苷類、甾體皂苷類和植源性蛻皮甾酮類等[2-4]，具有強心、抗腫瘤、抗炎鎮痛、抗菌及對呼吸中樞的興奮等藥理作用[5-6]。其中強心苷類成分是小桃兒七抗腫瘤的主要活性成分，逐漸受到國內外重點關注[7-9]。前期研究發現小桃兒七主要活性成分集中在正丁醇萃取部位，故本實驗對小桃兒七正丁醇部位進行分離純化，從中鑒定了2個新化合物分別為(25)-27-- β--葡萄吡喃糖基-3,25-二羥基螺甾-5(6)-烯- 1β-yl--α--阿拉伯吡喃糖苷[(25)-27--β-- glucopyranosyl-3,25-dihydroxyspirost-5(6)-en-1β-yl--α--arabinopyranoside，1]和3β,14β-二羥基-3β-(2-羥基丙酰氧基)-5α-蟾酥甾-20,(22)-二烯 [3β,14β- dihydroxy-3β-(lactate)-5αbufa-20,(22)-dienolide，2]，命名為鐵筷子苷M和鐵筷子苷N；細胞毒活性測試結果顯示化合物2表現出較好的腫瘤細胞生長抑制作用。

1 儀器與材料

島津半制備液相色譜儀（檢測器：SAD-20A；泵：LC-6AD）；半制備液相色譜柱Ultimate XB-C18（250 mm×10 mm，5 μm，月旭科技上海股份有限公司）；Bruker AVANCE 400型核磁共振波譜儀（瑞士Bruker公司）；色譜純甲醇、乙腈（天津市科密歐化學試劑有限公司）；分析純甲醇、三氯甲烷、石油醚（60～90 ℃）和正丁醇等試劑（天津市科密歐化學試劑有限公司）；氟尿嘧啶（5-FU，上海生物工程有限公司）；水為娃哈哈純凈水。人結腸癌細胞HCT116（ATCC目錄號：CCL-247）、人肺癌細胞A549（ATCC目錄號：CCL-185）、人肝癌細胞HepG2（ATCC目錄號：HB-8065）購于中國科學院上海細胞庫。

小桃兒七藥材于2016年6月購于陜西眉縣，經陜西中醫藥大學藥學院王薇教授鑒定為毛茛科鐵筷子屬植物鐵筷子Franch.的根及根莖，藥材標本（20160915）保存于陜西中醫藥大學藥學院中藥標本館。

2 方法

2.1 提取與分離

干燥的小桃兒七15 kg，粉碎后用10倍量60%乙醇回流提取3次，每次2 h。合并提取液，減壓濃縮至浸膏，用水分散后，分別用石油醚和正丁醇萃取3次，得石油醚部位（20 g）和正丁醇部位（1.5 kg）。取正丁醇部位（500 g）經硅膠柱色譜分離，以三氯甲烷-甲醇-水（100∶0∶0～65∶35∶1）洗脫，合并相同流分，分別得到10個組分Fr.1～10。Fr. 1（40 g）經硅膠柱色譜分離，以石油醚-醋酸乙酯（1∶0～3∶1）梯度洗脫，得到3個組分Fr.1-1～1-3。Fr.1-3（1.3 g）再經凝膠柱色譜分離，三氯甲烷-甲醇（1∶1）等度洗脫，得到化合物2（8.3 mg）。Fr. 9（200 g）經硅膠柱色譜分離，三氯甲烷-甲醇（100∶0～2∶1）梯度洗脫，得到4個組分Fr. 9-1～9-4。Fr. 9-2（650 mg）經高效液相色譜（HPLC），乙腈-水（24∶76）洗脫得到化合物1（9.2 mg，R＝56 min）。

2.2 酸水解實驗

化合物1稱取3 mg，采用課題組前期水解和衍生化方法得到糖的衍生物[10-11]，經Agilent 7890B氣相色譜儀分析，色譜柱：HP-5毛細管柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm）；程序升溫：起始溫度100 ℃，10 ℃/min升溫至240 ℃，1 ℃/min 升溫至260 ℃，保溫10 min，2 ℃/min 升溫至280 ℃，保溫5 min；進樣溫度250 ℃；載氣：氮氣。測得各單糖的保留時間分別為21.30 min（-葡萄糖）和19.28 min（-阿拉伯糖）。

3 結構鑒定

圖1 化合物1和2的結構

圖2 化合物1的關鍵1H-1H COSY、HMBC和NOESY相關信號

表1 化合物1的1H-NMR和13C-NMR數據 (400/100 MHz, C5D5N)

4 細胞毒實驗

根據課題組前期研究[4]，采用MTT法分別測定化合物1和2對HCT116細胞、A549細胞和HepG2細胞的細胞毒活性，5-FU為陽性藥。結果化合物2對3種腫瘤細胞的半數抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50）值分別為（10.8±0.4）、（4.8±0.7）、（45.3±1.8）μmol/L；化合物1對3種腫瘤細胞的IC50值均大于100 μmol/L；5-FU對3種腫瘤細胞的IC50值分別為（24.1±2.5）、（18.9±2.8）、（41.7±1.6）μmol/L。

圖3 化合物2的關鍵HMBC和NOESY相關信號

表2 化合物2的1H-NMR和13C-NMR數據(400/100 MHz, C5D5N)

5 討論

本實驗從小桃兒七中共分離鑒定了2個新的甾體類化合物，生物活性表明化合物2對3種腫瘤細胞表現出了較好的抗腫瘤活性，后期可針對其抗腫瘤機制進行深入研究。以上結果豐富了小桃兒七化學成分，為進一步闡明小桃兒七藥效物質基礎提供參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 宋小妹, 劉海靜. 太白七藥研究與應用 [M]. 北京: 人民衛生出版社, 2011: 208-211.

[2] 張慧. 藥用植物小桃兒七和秤桿七化學成分研究及生物活性初探 [D]. 天津: 天津大學, 2018.

[3] 王盈, 蘇艷芳, 楊鳳英, 等. 小桃兒七中的1個新化合物 [J]. 中草藥, 2013, 44(13): 1713-1716.

[4] Li Y Z, Huang W L, Zhang H W,. Steroidal components from the roots and rhizomes of[J]., 2022, 50: 31-35.

[5] 李朋收, 范冰舵, 劉洋洋, 等. 鐵筷子化學成分及藥理作用研究進展 [J]. 中華中醫藥學刊, 2014, 32(6): 1286-1289.

[6] Zhang H, Wei Z Y, Li Z P,. Three new spirostanol glycosides from[J]., 2020, 34(7): 975-980.

[7] Ma L, Meng Y Y, Tu C H,. A cardiac glycoside HTF-1 isolated fromFranch displays potentanti-cancer activity via caspase-9, MAPK and PI3K-Akt-mTOR pathways [J]., 2018, 158: 743-752.

[8] Deng L J, Hu L P, Peng Q L,. Hellebrigenin induces cell cycle arrest and apoptosis in human hepatocellular carcinoma HepG2 cells through inhibition of Akt [J]., 2014, 219: 184-194.

[9] Hou Y N, Shang C S, Meng T T,. Anticancer potential of cardiac glycosides and steroid-azole hybrids [J]., 2021, 171: 108852.

[10] Zhang D D, Wang W, Li Y Z,. Two new pregnane glycosides from[J]., 2016, 15: 142-146.

[11] Song X M, Li Y Z, Zhang Z L,. Two new spirostanol glycosides from the roots and rhizomes ofFranch [J]., 2023(2): 318-328.

[12] Mai N T, Cuc N T, Anh H L,. Steroidal saponins from[J]., 2017, 121: 1-9.

[13] Liu X T, Wang Z Z, Xiao W,. Cholestane and spirostane glycosides from the rhizomes of[J]., 2008, 69(6): 1411-1418.

[14] Qin X J, Sun D J, Ni W,. Steroidal saponins with antimicrobial activity from stems and leaves ofvar.[J]., 2012, 77(12): 1242-1248.

[15] Zhou S W, Zheng Q F, Huang X Y,. Isolation and identification of/-lactate-conjugated bufadienolides from toad eggs revealing lactate racemization in amphibians [J]., 2017, 15(26): 5609-5615.

[16] Meng Y, Whiting P, Sik V,. Ecdysteroids and bufadienolides from(Ranunculaceae) [J]., 2001, 57(3): 401-407.

Two new steroidal constituents from roots and rhizomes of

LI Yu-ze1, ZHANG Dong-dong1, JIANG Yi1, DENG Chong1, WANG Wei1, LIU Jian-li2, SONG Xiao-mei1

1. School of Pharmacy, Shaanxi University of Chinese Medicine, Xianyang 712046, China 2. College of Life Science, Northwest University, Xi’an 710069, China

To study the steroidal constituents from the roots and rhizomes ofand their cytotoxicity.A variety of modern separation chromatography techniques were used for separation and purification, and the structures of the new compounds were identified by MS, IR and NMR data, and their cytotoxic activities were screened by MTT method.Two new steroidal components were obtained from n-butanol fraction of ethanol extract ofand namely (25)-27--β--glucopyranosyl-3,25-dihydroxyspirost-5(6)-en-1β-yl--α--arabinopyranoside (1) and 3β,14β-dihydroxy- 3β-(lactate)-5αbufa-20,(22)-dienolide (2). The half inhibitory concentration (IC50) of compound 2 on human colon cancer HCT116 cells, human lung cancer A549 cells and human hepatocellular carcinoma HepG2 cells, respectively, was (10.8±0.4), A549 cells (4.8±0.7) and HepG 2 cells (45.3±1.8) μmol/L.Compounds 1 and 2 are new compounds named thibetanoside M and thibetanoside N, among which compound 2 exhibited moderate cytotoxicity.

Franch.; steroidal saponin; bufadienolide; cytotoxicity; thibetanoside M; thibetanoside N

R284.1

A

0253 - 2670(2023)15 - 4769 - 05

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.15.001

2023-03-09

陜西省中醫藥管理局項目（2021-02-22-017）；陜西省教育廳項目（22JK0344）；陜西中醫藥大學創新團隊項目（2023-CXTD-05）

李玉澤（1990—），男，博士，講師，研究方向為中藥藥效物質基礎研究。E-mail: lyz1990yeah@163.com

通信作者：宋小妹（1963—），女，博士，教授，研究方向為中藥藥效物質基礎研究。E-mail: songxiaom@126.com

[責任編輯 王文倩]