蛋鴨坦布蘇病毒和鴨疫里默氏菌混合感染的診斷

張光潔，全秀振，李小敏，譚 軍

1.湖南省衡陽市畜牧水產事務中心，湖南衡陽 421001；2.湖北省黃石市佳興生物科技有限公司，湖北黃石 435100；3.湖南省衡陽市病害豬無害化處理中心，湖南衡陽421001

蛋鴨是我國的主要養殖產業之一，為滿足人民群眾的生活需求，養鴨規模加大，鴨病的發生率也顯著升高[1]。在眾多鴨病中，鴨坦布蘇病毒（DTMUV）和鴨疫里默氏桿菌（RA）這2 種病原體引起的疾病對蛋鴨和肉鴨經濟造成了嚴重危害[2]，其中DTMUV會使產蛋量急劇下降，最嚴重的可導致絕產，RA 是目前養鴨業中最嚴重的致病菌之一，發病率高，疫苗交叉保護有限，二者影響了養鴨行業的健康發展[3]。在臨床實際情況中，鴨病的發生少見單個病原體感染，常為混合感染或繼發感染，為鴨病的診斷和防治帶來了很大的困難[4]。本研究運用病理剖檢、細菌分離鑒定、病毒PCR 檢測等方法，對湖南省某鴨場患病鴨進行疾病診斷，為這2 種病原體混合感染的診斷提供依據。

1 材料與方法

1.1 主要設備及試劑

無支原體胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司）；0.25%胰酶溶液（吉諾生物醫藥技術有限公司）；Taq DNA 聚合酶、Eastap Buffer、1dNTP（北京全式金生物技術有限公司）；Omega 膠回收試劑盒（北京Solarbio 科技有限公司）；瓊脂糖凝膠回收試劑盒（Gel Extraction Kit(200)，OMEGA 公司，貨號D2500-02）；反轉錄試劑盒（TaKaRa 公司，貨號RR047A）；TRIzol試劑（Invitrogen 公司，貨號15596-026）；Tris-Hcl、Maleic acid Mo375（Sigma 公司）；DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit Ⅰ（Roche公司，貨號14761221）；全自動脫水機、自動染色封片一體機（德國萊卡公司），Nikon80i 生物光學顯微鏡為上海橫橋儀器有限公司產品。

1.2 病料的來源及處理

本研究中病鴨來源于湖南某鴨場發病的80 日齡蛋鴨，首先對病鴨的發病情況和臨床癥狀進行了解，隨后對送檢發病蛋鴨進行剖檢，觀察并記錄各組織器官的病理變化。取病鴨腦組織做細菌的分離培養；取腦和卵巢組織用于病毒檢測鑒定；取病鴨的腦、脊髓、坐骨神經、肝臟、心臟、卵巢等器官組織置于10%中性福爾馬林溶液固定。

1.3 細菌的分離鑒定

1）細菌分離純化。無菌挑取病鴨的腦組織，參照文獻[4]的方法進行細菌的分離純化。

2）細菌16S rRNA。參照文獻[5]設計上游引物F：5’-GAGTTT-GATCMTGGCTCAG-3’，下游引物R：5’-TACCTTGTTA-CGACTT-3’。參照文獻[5]進行細菌DNA 提取、PCR 擴增，測序，結果與Gen－Bank 上的序列進行BLAST 比對分析，引物合成及測序均送生工生物工程（上海）股份有限公司進行。

1.4 病毒的分離鑒定

參照文獻[6]設計上游引物F：5’-AGACTGCTG GTGCAATGAGAC-3’，下游引物R：5’-CGGTACCAT AATCCTCCATCTCAGC-3’，送至生工武漢技術部合成，其擴增的預期片段大小為300 bp。參照文獻[6]進行病毒特異性序列的擴增，擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，并用凝膠成像系統拍照分析。

1.5 病鴨的組織病理學觀察

采取的固定組織常規石蠟包埋、切片、常規HE染色。通過NIS-Elements 高清晰度彩色圖文分析系統配合Nikon80i 生物光學顯微鏡對組織病理變化進行觀察記錄。

2 結果與分析

2.1 發病情況、臨床癥狀及剖檢變化

某鴨場自然發病的80 日齡蛋鴨，臨床癥狀主要表現精神萎靡不振，頭頸震顫，癱瘓，無法行走（圖1A）。剖檢可見肝、心表面有白色膜狀滲出物，其他各臟器未發生明顯異常（圖1B）。

圖1 病鴨的臨床癥狀和剖檢變化

2.2 細菌的分離鑒定結果

腦病料無菌接種5%血清的TSA 培養皿，經培養約36 h 后，在平板上有細小的圓形、凸起菌落生長，呈透明露珠樣，革蘭氏染色顯示為陰性短桿菌。

提取分離細菌的DNA，進行PCR 擴增，其擴增產物的電泳結果可見片段大小為1 500 bp 左右，與預期結果相符。將PCR 產物送去測序，將測序結果在NCBI BLAST 上分析比對，發現序列與鴨疫里默氏桿菌的相似度在98%以上。根據國際分類標準，可確定細菌為鴨疫里默氏桿菌。

2.3 鴨坦布蘇病毒的檢測與鑒定

從本試驗的電泳結果中可以看出，擴增產物的條帶處于300 bp 的位置，與預期擴增片段的大小一致。將PCR 產物送去測序，將序列在NCBI BLAST 上分析比對，發現序列與鴨坦布蘇病毒相似性在99%以上。根據國際分類標準，可確定病毒為鴨坦布蘇病毒。

2.4 病理組織學檢查結果

病鴨的主要病變是腦血管周圍間隙增大，水腫，淤血，腦組織出現衛星現象和噬神經元現象（圖2A）；脊髓有局灶性出血和衛星現象（圖2B）；坐骨神經水腫，神經纖維壞死、鈣化（圖2C）；卵巢血管周圍出現巨噬細胞、異嗜性粒細胞等炎性細胞浸潤（圖2D）；卵泡未見明顯異常；心外膜、肝被膜增厚，表面附有大量纖維素性滲出物，其中有大量異嗜性粒細胞和淋巴細胞浸潤（圖2E、圖2F）。

3 討論

本研究通過細菌的分離鑒定和病毒的PCR 檢測，該群病鴨為鴨坦布蘇病毒和鴨疫里默氏桿菌的混合感染。鴨疫里默氏桿菌主要危害1～8 周齡尤其是1～3 周齡的雛鴨，最主要的臨床病理特征是廣泛的纖維素性漿膜炎[5]。鴨坦布蘇病毒病感染蛋鴨的主要癥狀表現為采食量下降，產蛋下降和神經癥狀[7-8]。其中，雛鴨感染DTMUV 主要癥狀表現為采食量下降，共濟失調。鴨對鴨坦布蘇病毒的易感性與日齡呈相關性，且日齡越小越易感[9]。本研究中發病鴨為80 日齡蛋鴨，未到產蛋年齡，主要臨床癥狀為精神萎靡，出現劃水樣動作，無法走路。病理組織檢查結果大腦、脊髓和坐骨神經均有明顯病理損傷，卵巢有炎癥，肝、心漿膜有明顯的纖維素性炎，符合鴨坦布蘇病毒和鴨疫里默氏桿菌混合感染的病理特征。

雛鴨感染坦布蘇病毒，主要表現為神經系統損傷，感染該病毒后還會使病鴨免疫力下降，有免疫抑制作用[10-11]。因此，感染鴨坦布蘇病毒后，病鴨容易繼發感染其他病原體。分析推測本研究中病鴨感染鴨坦布蘇病毒病后免疫力下降，繼發鴨疫里默氏桿菌感染導致混合感染。在日常飼養中，應加強鴨場的生物安全措施落實，做好疾病防控。在感染坦布蘇病毒時，應及時隔離治療，避免繼發感染其他病原體。