豬瘟病毒裝甲RNA顆粒質控品的研制及評估

鄧俊花，陳冬杰，魏 方，吳紹強

中國檢驗檢疫科學研究院，北京100176

豬瘟(classical swine fever,CSF)是一種由經典的豬瘟病毒（CSFV）引起的高度接觸性、傳染性疾病，為我國二類動物傳染病，同時也是OIE 必報疫病。該病的高發病率和高死亡率給全球范圍內的養豬業造成巨大經濟損失，嚴重危害畜牧業的發展。目前，國內豬瘟疫情的主要特點為溫和性、散發性、多種病原混合感染、隱性感染和亞病毒感染等，非典型豬瘟病理變化的情況時有發生[1]，這對CSF 的臨床診斷帶來了很大的困難。

目前，國內外許多研究者建立了豬瘟病毒分子生物學診斷方法[2-12]。但是，由于缺乏安全穩定的陽性質控品，使得豬瘟核酸檢測方法很難做到全程監控。利用Amored RNA 技術制備的裝甲RNA 顆粒穩定、易保存、安全性高，能模擬天然病毒結構特性，與臨床樣本保持一致，可作為核酸提取、擴增和擴增后分析等各個環節的質控，確保結果的真實可靠，可有效克服傳統RNA 物質存在的缺陷[13-19]。本研究采用一種新型裝甲RNA 表達載體，將豬瘟檢測靶基因構入其載體，制備的裝甲RNA 顆粒能夠代替真病毒或質粒等物質，用于該病核酸檢測的質控，為豬瘟疫病監測提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 菌株、質粒及試劑

豬瘟活疫苗（兔源）國家參考品，源自法國Thiverval 株(S0521207)，購自中國獸醫藥品監察所；載體質粒pTMACC，由中國檢科院實驗室構建保存；In-HD Cloning Kit (Clontech)及DNA 連接試劑盒(Takara)購自寶日醫生物技術（北京）有限公司；異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)，RNeasy MiNi Kit（Qiagen）購自北京宏捷科技有限公司；MagneHisTMprotein purification system（USA）購自promega 公司。

1.2 pTMACC-CSFV 裝甲RNA 制備

豬瘟活疫苗提取RNA 核酸后，采用下列引物進行RT-PCR 擴增。引物序列為：CSFV-F：5’-CG GGGTACCTACGAGGTTAGTTCATTCTC-3’，CSFVR：5’CCCAAGCTTGTAGGTTCTTCAGTGTTG-3’。純化的PCR 產物與pTMACC 質粒經KpnI 和HindIII雙酶切、連接、轉化，制備重組菌pTMACC-CSFV。該重組菌加入終濃度為0.5 mmol/L IPTG，28 ℃誘導表達。表達產物加入終質量濃度1.25 mg/L 溶菌酶37 ℃溫和裂解，上清采用噬菌體純化方式制備粗純的CSFV 裝甲RNA 顆粒。粗純產物采用Magne－HisTM protein purification system 系統純化后即為pTMACC-CSFV 裝甲RNA 物質。

1.3 pTMACC-CSFV 裝甲RNA 結構分析

采用SWISS-model 軟件對該顆粒外殼蛋白結構進行預測分析，結合SDS-PAGE 電泳分析，以驗證該顆粒為MS2 噬菌體-double CP 結構；同時，該物質經80 ℃加熱5 min，觀察溶液變化，并采用瓊脂糖電泳分析，以驗證該物質內含核酸類型為RNA。

1.4 pTMACC-CSFV 裝甲RNA 形態學鑒定

CSFV 裝甲RNA 物質經1%醋酸雙氧鈾染色，利用透射電鏡（JEM1400）進行形態觀察；同時，該物質顆粒溶液借助動態光散射儀，測定其粒子徑的大小以及溶液的均勻狀態。

1.5 pTMACC-CSFV 裝甲RNA 顆粒序列溯源性分析

CSFV 裝甲RNA 物質送擎科生物測序公司進行靶基因序列測定，并進行序列溯源性分析。

1.6 pTMACC-CSFV 裝甲RNA質控品均勻性分析

pTMACC-CSFV 裝甲RNA 質控品參考國家標準GB/T 15000-3《樣品工作導則》分裝，依據標準GB/T 27540—2011《熒光RT-PCR 方法》進行均勻性評價。隨機抽測10 份，每份重復檢測3 次，檢測數據采用方差統計分析，以評估該質控品的均勻性。

1.7 pTMACC-CSFV 穩定性分析

pTMACC-CSFV 裝甲RNA 質控品在4、-20 ℃分別保存14 d、1 個月、2 個月、3 個月、6 個月、12個月、24 個月、36 個月。每種條件2 份，每份重復檢測3 次。檢測數據采用t 檢驗統計，結合趨勢分析，評估該質控品的穩定性。

1.8 實用性能檢測

pTMACC-CSF 裝甲RNA 質控品送豬瘟病毒WAOH 參考實驗室中國獸醫藥品監察所等8 家權威檢測機構進行性能評價。

2 結果與分析

2.1 CSFV 靶基因PCR 擴增

以豬瘟活疫苗為模板提取RNA，并采用靶基因兩端特異性引物進行RT-PCR 擴增。瓊脂糖電泳顯示靶基因條帶為500～750 bp，與預期大?。?68 bp）相符（圖1）。

圖1 靶基因PCR 產物電泳圖

2.2 pTMACC-CSFV 裝甲RNA 結構分析

借助蛋白三維模擬器（SWISS-model）對pTMACC-CSFV 裝甲RNA 外殼蛋白（double-CP）結構與野生型MS2 噬菌體中single-CP 結構分別建模（圖2）。純化的裝甲RNA 顆粒進行SDS-PAGE 電泳分析（圖3、圖4），顯示目的蛋白位于26～42 kμ，約是野生型MS2 噬菌體外殼蛋白分子質量（13.7 kμ）的2 倍，與建模預測分析一致。該物質溶液經過80 ℃熱處理后，肉眼可見溶液由透明狀變乳白色，瓊脂糖電泳顯示：加熱后該物質特征性條帶呈彌散性直至消失，源自該裝甲RNA 顆粒為RNA-蛋白復合物，熱處理后蛋白外殼變性，包裹RNA 核酸被釋放。

圖2 噬菌體MS2 中外殼蛋白改造的蛋白三維構象模型對比分析

圖3 pTMACC-CSFV裝甲RNA顆粒SDS-PAGE 電泳分析

圖4 pTMACC-CSFV 裝甲RNA 顆粒核酸電泳分析

2.3 pTMACC-CSFV 裝甲RNA 形態學鑒定

純化的裝甲RNA 顆粒，經1%醋酸雙氧鈾染色后，透射電鏡觀察（圖5）：顆粒為“外亮內暗”規則的多邊形物質，直徑約26 nm。該物質經動態光散射圖譜分析（圖6）：光譜單一，且顆粒粒徑主要分布于20～50 nm，且均值在26 nm 左右，表明溶液均勻分布，沒有顆粒聚集現象，且粒徑大小與透射電鏡數據吻合。

圖5 pTMACC-CSFV 裝甲RNA 顆粒透射電鏡圖

圖6 pTMACC-CSFV 裝甲RNA 顆粒動態光散射圖譜

2.4 裝甲RNA 顆粒序列溯源性分析

該物質測序后核酸序列圖譜分析表明，插入靶標序列為豬瘟病毒5’UTR 特定序列，溯源至WAOH 豬瘟參考實驗室法國Thiverval 株（位點1～550 bp），二者同源性達99%。

2.5 pTMACC-CSFV 裝甲RNA 質控品均勻性分析

pTMACC-CSFV 裝甲RNA 均勻性檢測數據分布如圖7。采用F 檢驗統計分析，F=0.513<2.94，且P=0.848，表明該質控品批內精密度和總精密度差異均無統計學意義，呈均勻分布。

圖7 pTMACC-CSFV 裝甲RNA 質控品均勻性分析圖

2.6 pTMACC-CSFV 裝甲RNA 質控品保存穩定性分析

pTMACC-CSFV 裝甲RNA 質控品在不同的保存條件下，檢測數據統計分布如圖8，檢測Ct 值采用t 檢驗統計分析。結果顯示，冷藏條件下，該質控品穩定保存6 個月，-20 ℃保存條件下該質控品能夠穩定保存36 個月。

圖8 pTMACC-CSFV 裝甲RNA 質控品保存穩定性及趨勢分析圖

2.7 實用性能檢測

pTMACC-CSFV 裝甲RNA 質控品經8 家權威實驗室進行性能評估。檢測Ct 值在20.12～22.07，符合豬瘟方法核酸陽性質控品的要求，能夠應用于豬瘟臨床檢測。

3 討論

豬瘟和非洲豬瘟均是危害世界養豬業的嚴重傳染病，在臨床和病理方面難以區分[20]。面臨非洲豬瘟疫情防控的嚴峻形勢，豬瘟疫病的監測也刻不容緩。隨著豬瘟核酸檢測技術的普及，一種安全、穩定、高效的陽性質控物質迫切急需。

本研究依托改造后的Armored RNA 技術，采用了一種新型高效的裝甲RNA 表達載體。此載體不僅能表達高達2 000 bp 的外源RNA 片段，而且優化了純化工藝，在保證簡化工藝的同時提高了裝甲RNA 顆粒的產量。特定CSFV 靶基因插入該表達載體，制備了豬瘟裝甲RNA 物質。該物質為RNA-蛋白復合物，即豬瘟靶基因對應的RNA 核酸被噬菌體外殼包裹，形成類似天然病毒的結構，即核酸不易降解、又無生物安全風險，是良好的核酸檢測質控品，能夠監測豬瘟病毒相關核酸檢測方法中核酸抽提、反轉錄、擴增全流程，同時避免了質粒作為質控品易污染環境、干擾檢測結果等弊端。豬瘟病毒裝甲RNA 質控品均勻性良好，且穩定性強。在本研究中，-20 ℃保存環境下檢測數據經t 檢驗，t<0.05（df-1）,且0.01＜P＜0.05，有差異，源于36 個月檢測值與對照均值差異，但該差異程度在可接受范圍內。因此，-20 ℃分裝保存至少可穩定36 個月。該質控品無生物傳染性，核酸RNA 不易降解，穩定保存，且特殊結構能夠對RNA 病原核酸檢測三步流程的全程質控，更進一步保障豬瘟疫病的臨床檢測的準確性。