土壤中有效硼含量測定方法優化與對比

占國艷 潘 政 梁紅芳 潘曉威 梁耀輝 曾紹東 葉劍芝*

(1.中國熱帶農業科學院 農產品加工研究所/農業農村部農產品加工質量安全風險評估實驗室(湛江),廣東 湛江 524001;2.江蘇丘陵地區鎮江農業科學研究所/中心實驗室(句容),江蘇 句容 212400)

土壤中微量元素是農作物需求很少但必不可少的元素,對作物生長調節及產量調控起到重要的作用[1]。例如硼是農作物必需微量元素,對作物生殖器官的形成和發育起重要作用,硼還能增加作物的抗逆性,增強作物的抗旱、抗病能力等。硼素供應不足,會導致植株生長不良,產品的質量和產量下降[2-3]。作物吸收的硼主要來自土壤,土壤的含硼量對其至關重要。一般作物直接從土壤中吸收的是有效態的硼,土壤中有效硼含量在0.5～1.0 mg/kg時對作物生長是最有利的,過高或過低都會對農作物產生不良影響[4-5]。準確測定土壤中有效硼含量有助于合理評價及調控土壤中有效硼含量,對指導農業生產具有重要意義。另外有效硼是全國測土配方施肥項目必測元素之一,也是《耕地質量調查監測與評價辦法》中長期監測的指標,同時第三次全國土壤普查也將其納入監測指標體系中,因此準確高效測定土壤中的有效硼尤為重要。

土壤中有效硼含量的測定常采用分光光度法,包括姜黃素分光光度法[6]和甲亞胺-H分光光度法[7],兩種方式均是將土壤樣品直接煮沸后加入姜黃素或甲亞胺-H進行分光光度法測定。姜黃素分光光度法操作復雜,對樣品反應過程控制要求嚴格,實際測試采用較少[8]。甲亞胺-H分光光度法操作簡單快速,適合多個樣品測定,也適合有效硼含量較高樣品的測定,方法應用比較普遍。但其靈敏度較低,顯色溫度及光照等因素容易對測試結果造成干擾[9]。另外有效硼的測定前處理方式是采用直接煮沸的方式進行處理,煮沸時間以及煮沸強度等不易控制,常會造成結果出現較大偏差[10],且直接煮沸所需的石英玻璃耗材昂貴,成本過高。已有研究對有效硼測定前處理過程進行優化,比如采用沸水浴浸提法[11]、微波提取法[12]等。其中沸水浴浸提法成本低、容易控制、效率高等,已被普遍認為適用于有效硼測試前處理過程[13]。目前關于沸水浴浸提法的浸提時間、浸提方式等研究較多,但結論較多,尚不統一;而且目前關于分光光度法測定有效硼含量的方法研究對顯色過程的影響分析不足。

鑒于此,在前人的研究基礎上,對沸水浴浸提分光光度法測試土壤有效硼的過程進行全流程的分析,重點考察浸提時間和浸提方式的影響,同時對顯色過程中溫度及光照等因素影響進行分析,以進一步優化沸水浴浸提甲亞胺-H分光光度法測試有效硼的條件,獲得更準確有效的結果。同時考慮到隨著檢測技術和設備的不斷發展,越來越多的實驗室有條件采用電感耦合等離子體發射光譜法測試土壤有效硼含量[13-14],本文對ICP-OES法測定土壤有效硼進行驗證對比,結合在第三次全國土壤普查內業檢測試點工作中的經驗概括歸納兩種方法的優點、不足及適用范圍,以期為“三普”內業檢測提供技術參考和借鑒。

1 實驗部分

1.1 儀器與材料

AUY 120電子天平(島津儀器)、DTT-A1000恒溫培養箱(上海一恒科學儀器有限公司)、HH-4恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司)、722N可見分光光度計(上海儀電分析儀器有限公司)以及電感耦合等離子體發射光譜儀(Thermo Fisher Scientific、ICAP7200)等。

硫酸鎂(MgSO4·7H2O)、硫酸(1/2H2SO4)、高錳酸鉀(1/5KMnO4)、甲亞胺、抗壞血酸、乙酸銨及EDTA二鈉鹽等,均為分析純。實驗所用水為現制備的一級水,硼標準儲備溶液(100 μg/mL)購于中國計量科學研究院。

土壤有效態成分標準土壤樣品均為中國地質科學院地球物理地球化學勘查研究所研制,定值日期為2022年4月,有效期為5年,現均在有效期內。

1.2 實驗方法

1.2.1 有效硼浸提劑的配制

硫酸鎂浸提劑:準確稱取1.0 g硫酸鎂溶解于水中,并稀釋至1 L,即得到濃度為1 g/L的硫酸鎂溶液。

1.2.2 土壤有效硼的提取

稱取10.00 g土壤樣品于50 mL塑料瓶中,加1 g/L的硫酸鎂溶液20 mL,塞好瓶蓋,搖勻,在100 ℃的恒溫水浴鍋中加熱浸提12 min,取出后稍冷后一次性過濾于塑料燒杯中,濾液作為待測溶液。

1.2.3 試樣的測定

分光光度法:吸取過濾后的濾液4 mL于10 mL塑料分光光度管中,加入0.5 mL酸性高錳酸鉀溶液,搖勻,放置2～3 min,加入0.5 mL抗壞血酸溶液(100 g/L),搖勻,待紫紅色消褪且褪色的二氧化錳沉淀完全溶解后,加5.00 mL混合顯色劑,搖勻,于23 ℃的恒溫培養箱避光放置1 h,取出后于波長415 nm處,用2 cm光徑比色皿進行分光光度測定。以扣除空白后的吸光值查校準曲線得到待測液的硼含量。

ICP-OES法:過濾后的試液直接上機測試,從儀器的校準曲線中直接讀取有效硼濃度值。儀器測試參數為:射頻功率為1 150 kW,載氣為高純氬氣(純度≥99.99%),輔助氣流量為0.5 L/min,霧化器氣體流量為開,泵速45 r/min,元素分析譜線為208.89 nm。

1.2.4 標準溶液及標準曲線的繪制

分光光度法:吸取2.50 mL硼標準溶液于25 mL容量瓶中,用水定容,得到10 mg/L硼標準儲備溶液,儲于塑料瓶中。然后吸取10 mg/L硼標準溶液0、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL于7個50 mL容量瓶中,用水定容,得到0、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mg/L硼標準系列溶液,將上述標準系列溶液保存在塑料瓶中。分別吸取0、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mg/L硼標準系列溶液4.00 mL于10 mL塑料比色管中,硼的含量分別為 0、0.4、0.8、1.6、2.4、3.2、4.0 μg,同試樣測定方法操作步驟測定。用標準系列溶液的零濃度調節儀器零點,計算回歸方程及繪制工作曲線。

ICP-OES法:將0、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mg/L硼標準系列溶液依次上機測試,在208.89 nm波長下以硼的質量濃度為橫坐標,以發射強度值為縱坐標,建立校準曲線。

1.3 數據處理

所有統計分析均使用Microsoft Excel 2010和SPSS 25.0進行,圖形使用Origin 2018軟件繪制。

2 結果與討論

2.1 水浴浸提時間的選擇

采用沸水浴浸提方法提取土壤樣品中有效硼含量時,浸提時間是影響有效硼含量測定準確度的關鍵因素之一。若浸提時間過短,土壤中硼在浸提劑中溶解未達到平衡,提取不充分,所測的有效硼含量會偏低。浸提時間太長,則會耗費過多時間,降低測試效率。前人對浸提時間已有過研究,但結論在4～50 min,差異較大[12,15]。為優化浸提過程,確定最佳浸提時間,本文擬對沸水浴浸提方式不同時間內所提取的有效硼含量變化進行分析。

選取4個不同含量的標準土壤樣品[ASA-5b(0.26 mg/kg±0.05 mg/kg)、ASA-6b(0.13 mg/kg±0.04 mg/kg)、ASA-7a (0.68 mg/kg±0.08 mg/kg)、ASA-9a(0.43 mg/kg±0.05 mg/kg)]進行實驗,按照提取步驟進行操作,將裝有浸提劑和土壤樣品的瓶子放置在沸騰的水浴鍋中,并開始精確計時4、8、12、20、30、50 min,取出后顯色測定有效硼含量,所測得的有效硼含量隨浸提時間變化情況如圖1所示。

圖1 有效硼測試結果隨浸提時間變化情況Figure 1 Change of available boron test results with the leaching time.

由圖1中可以看出,不同浸提時間所獲得的有效硼含量存在較大差異。具體來看,前期浸提時間在12 min內,浸提時間越長,所測得的土壤有效硼含量越高,后面繼續延長浸提時間,有效硼含量變化不大。通過將所測的有效硼含量值與標準值比較,并計算相對誤差,以判斷測定結果的準確度。圖1顯示在浸提12 min后,所得的有效硼含量已接近標準值,相對誤差也較低(8%),準確度較好,之后繼續浸提,有效硼含量變化不大。當浸提時間達到50 min后,有效硼含量相比12 min時有所增加,偏離標準值,且相對誤差較大(15%)。

保證土壤樣品中的有效硼能被浸提劑充分提取是獲得準確有效硼含量的關鍵。研究發現,采用沸水浴浸提方式12 min即能將土壤中的有效硼充分提取出來,之后繼續浸提,有效硼含量會有增加,這可能是浸提時間過長,除了有效硼被提取,還有部分其他形態的硼被提取出來,使得測定結果偏高[11]。因此,沸水浴浸提時間選擇12 min。

2.2 水浴浸提方式的選擇

在得出了沸水浴浸提土壤有效硼適宜浸提時間后,嘗試探究沸水浴浸提方式下是否加蓋浸提對提取土壤有效硼的影響。選取4個不同含量的標準土壤樣品,按照提取條件進行提取,并設計加蓋密閉浸提和不加蓋敞開浸提兩種方式進行比較。兩種方式下對土壤樣品浸提12 min后,測定土壤樣品中有效硼含量。不同浸提方式下所測定的有效硼含量差異如圖2所示。

圖2 不同浸提方式下測定的有效硼含量差異Figure 2 Difference of available boron content determined by different leaching methods.

從圖2中可以看出,兩種浸提方式下所測定的有效硼含量差異不明顯。同一土壤樣品重復平行性標準偏差為0～4%,所測定的結果穩定性較好。不同土壤所測的結果均在標準值范圍內,相對誤差0～8%。說明兩種浸提方式測定的結果都能有較好的穩定性和準確性,是否加蓋浸提對提取土壤有效硼沒有明顯的影響。鑒于開蓋方式會存在浸提液傾灑的風險,導致測試出現誤差,所以實際測試過程中推薦采用加蓋浸提方式為佳。

2.3 顯色條件的優化

由上述的研究可知,對分光光度法測試土壤有效硼的前處理過程進行優化可以提高測定有效硼含量的準確性。除此之外,分光光度法測試中顯色過程對測試結果也會產生一定的影響,往往顯色時間和溫度等條件的不同,測試結果會出現較大的差異。對于土壤有效硼的測試,NY/T 1121.8—2006[7]對于顯色過程沒有特別說明,然而在實際操作過程中發現,按照NY/T 1121.8—2006操作后,顯色結果并不理想,分析原因后推測可能是沒有對顯色過程中的光照和溫度條件進行控制。為了驗證推論并對顯色過程進行優化,本研究采用避光恒溫的方式顯色,以便更好地控制顯色過程,并和常規顯色方式進行比較,分析光照和溫度對顯色過程的影響以及避光恒溫方式顯色的效果。

選取4個不同含量標準土壤樣品按照確定的提取方式進行浸提,即加硫酸鎂溶液20 mL,沸水浸提12 min后取出過濾,按照實驗方法繪制標準曲線和測試濾液中有效硼含量。同時按照NY/T 1121.15—2006方法將顯色液配制好放置1 h后進行顯色測試。按照兩種方式顯色所繪制的標準曲線和所測的土壤樣品有效硼含量分別如圖3和圖4所示。

圖3 不同顯色方式下繪制的標準曲線Figure 3 Standard curves drawn under different color rendering methods.

圖4 不同顯色方式下測定的有效硼含量差異Figure 4 Difference of available boron content determined by different color rendering methods.

從圖3、4的結果能夠看出,兩種方式處理顯色后所繪制的標準曲線差異很大,并且所測得的土壤有效硼含量相差較大。圖3顯示按照標準推薦的常規顯色方式所繪制的曲線線性較差,相關系數r只有0.996 9,表明這種方式不能有效地控制顯色過程的光照和溫度等因素影響,使顯色過程出現較大偏差,直接導致后續樣品測試結果不準確。相比之下,采用避光恒溫的方式結果較好,顯色后所繪制的曲線相關系數r為0.999 7,顯著優于恒溫顯色的方式(p<0.05),表明這種方式能夠很好地改善顯色過程中光照和溫度等因素影響,后續樣品測試結果也更準確。圖4中兩種顯色方式下所測得的土壤有效硼含量也有顯著不同(p<0.05),主要表現為常規顯色方式所測得的有效硼含量普遍偏低,甚至低于標準值的不確定度范圍,相對誤差較高(13%～31%)。相比之下,避光恒溫方式所測得的有效硼含量準確度較好,相對誤差較低(0～8%)。另外從圖4中可以看出,采用避光恒溫方式顯色所測得的重復土壤樣品平行性也更好,標準偏差為1%～2%,說明采用避光恒溫方式顯色可以獲得較為穩定的結果。

對分光光度法測試土壤有效硼方法顯色過程進行優化,可以有效地提高測試結果的穩定性和準確性。結果表明,光照和溫度會對有效硼測試顯色過程產生較大的影響,光照的影響和溫度不穩定會導致顯色過程出現較大偏差,從而使得測定的結果明顯偏低。顯色劑中的甲亞胺-H酸不穩定,遇光容易分解,致使顯色過程不穩定,影響結果的測定[13]。另外,由于甲亞胺-H試劑顏色較深,對吸光度的影響較大,溫度的變化容易影響硼與甲亞胺-H酸絡合物穩定性,進而容易引起吸光度的變化,對測定結果造成較大誤差[15]。因此,在實際測試時有必要在顯色過程中避免光照的影響以及保持顯色過程溫度的穩定。

2.4 測試有效硼的方法對比

在探討了分光光度法測試土壤有效硼的一些優化措施后,擬對優化后分光光度法測試土壤有效硼的準確性進行驗證,并對ICP-OES法測定土壤有效硼進行探討,從檢出限及定量限、線性范圍、精密度、準確度等參數對分光光度法和ICP-OES法測試土壤有效硼進行對比分析。

2.4.1 校準曲線和檢出限

分光光度法按照測定步驟對工作曲線進行測定,以吸光度為縱坐標,以溶液中硼含量為橫坐標,繪制標準曲線,并進行線性回歸。結果表明,當硼含量范圍為0～4.00 μg時,工作曲線線性方程較好,相關系數r為0.997,符合分析測試的要求。ICP-OES法參照儀器工作條件在208.89 nm波長下對硼工作曲線進行測定,選取配制好的標準系列溶液,以硼的質量濃度為橫坐標,以發射強度值為縱坐標,建立校準曲線。結果表明當硼的質量濃度范圍為0～1 000 μg/L時,工作曲線線性方程較好,相關系數r為0.999 9,符合分析測試的要求。對兩種測試方法測定并擬合得出的校準曲線如圖5所示。

圖5 分光光度法及ICP-OES法測試有效硼的工作曲線Figure 5 Working curve of available boron tested by spectrophotometric method and ICP-OES method.

檢出限按照《環境監測分析方法標準制訂技術導則》(HJ 168—2020)中的具體要求執行。分別對空白樣品進行8次獨立測試,方法檢出限參照HJ 168—2020的附錄A進行計算,并以4倍檢出限作為測定下限。分光光度法、ICP-OES法測定有效硼的檢出限、測定下限見表1。分光光度法檢出限為0.012 mg/kg,測定下限為0.048 mg/kg;ICP-OES法檢出限低于分光光度法,為0.009 mg/kg,測定下限為0.036 mg/kg。

表1 檢出限、測定下限結果對比Table 1 Comparison of detection limit and lower limit of detection results(n=8) /(mg·kg-1)

2.4.2 方法精密度和準確度

分別選取高、中、低三個不同含量的有值標準土壤樣品(ASA-2b-CZ、ASA-6b-CZ、ASA-7a-CZ)按實驗方法每個樣品平行測定6次,并采用ICP-OES同樣測定6次。分別計算不同含量樣品的平均值、標準偏差、相對標準偏差等各項指標,同時和標準值進行對比,計算其相對誤差,兩種方式測定的不同土壤樣品有效硼含量精密度和準確度測試結果見表2。結果顯示,不同標準土壤樣品的測定結果均在標準值范圍內,相對標準偏差<10%,相對誤差<10%,精密度和準確度均滿足《合格評定 化學分析方法確認和驗證指南》(GB/T 27417—2017)的要求。

表2 精密度及準確度測試結果對比Table 2 Comparison of precision and accuracy test results /(mg·kg-1)

2.5 實際樣品比對測試

為進一步驗證顯色法和ICP-OES法測試的適用性,選取我國江西、四川以及安徽等地的農用地土壤為代表,采用兩種方法進行土壤有效硼測試比對。每種土壤平行測定三次,計算平均值及標準偏差,測定結果如表3所示。結果表明分光光度法測試標準偏差為1%～3%,ICP-OES法測試標準偏差為0.5%～0.8%。兩種方法均可用于土壤有效硼的測定,并且二者的測定結果無顯著性差異,但ICP-OES法測試結果標準偏差更低,穩定性較好。

表3 實際樣品有效硼測試結果Table 3 Available boron test results of actual samples /(mg·kg-1)

分光光度法的檢出限(0.012 mg/kg)略高于ICP-OES法(0.009 mg/kg),采用不同方法測試有效硼時將導致結果存在一定的誤判率,即當樣品的含量介于0.009～0.012 mg/kg時,分光光度法的測定結果為未檢出,ICP-OES法的測定結果為檢出。因此,在分析測試實際土壤樣品中有效硼含量時應根據實際需求合理選擇檢測方法。鑒于第三次全國土壤普查工作的科學性、嚴謹性,建議選取ICP-OES法測定土壤中有效硼。另外,ICP-OES法的精密度和準確度都優于分光光度法,實際樣品測試也顯示ICP-OES法獲得的結果更為穩定。我國土壤中的有效硼含量尤其是東南地區土壤中的有效硼含量普遍較低(<0.5 mg/kg)[16],分光光度法測試過程相對繁瑣,對于低含量的土壤測試也更容易產生誤差。ICP-OES法因為不需要加各種顯色劑顯色處理,所以檢測簡便,所得的結果也更準確和穩定,對于低含量有效硼的測試更為有效。

3 結論

對沸水浴浸提分光光度法的測試條件進行了分析并提出了優化措施,以及從檢出限及定量限、線性范圍、精密度、準確度等條件對分光光度法、ICP-OES法進行了對比,比較兩種方法的優點和不足以及適用范圍,結果表明:

1)沸水浴浸提分光光度法測試土壤有效硼時提取時間選擇12 min、加蓋浸提以及23 ℃避光顯色處理,可以獲得更為準確的結果。

2)分光光度法檢出限為0.012 mg/kg,ICP-OES法檢出限為0.009 mg/kg,兩種方法的準確度和精密度均符合要求,均可用于土壤有效硼的測定并且二者的測定結果無顯著性差異。

3)對于硼含量(>0.5 mg/kg)高的樣品,分光光度法、ICP-OES法均適用,中、低含量(<0.5 mg/kg)樣品建議采用ICP-OES法測定。