新型冠狀病毒奧密克戎變異株無癥狀感染者新冠病毒全基因組測序分析#

周建松*吳若禹 簡潔 蔣家俊李莎 李婉宜 周琳琳△

（1.貴陽市疾病預(yù)防控制中心檢驗科，貴州 貴陽 550000；2.四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系，四川 成都 610000）

新型冠狀病毒（Sever acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2，以下簡稱“新冠病毒”）屬于冠狀病毒科β屬冠狀病毒屬，是迄今為止被發(fā)現(xiàn)的冠狀病毒中第7種可以使人類致病的冠狀病毒，其全基因組包含近30000個核苷酸堿基，由14個蛋白編碼區(qū)域構(gòu)成[1]。自從2020年初2019冠狀病毒病 (COVID-19) 大流行開始以來，全世界已出現(xiàn)了一系列新冠病毒的變異株。2021年11月24日，南非首次向WHO報告了奧密克戎變異株感染病例，該變異株較其它變異株突變位點更多，且有更強的傳染性和免疫逃逸能力，在短時間內(nèi)迅速傳播至全球多個國家和地區(qū)[2,3]。之后，奧密克戎變異株BA.1亞型迅速取代其他變異株成為優(yōu)勢流行毒株，并在全球多個國家和地區(qū)傳播，對公共衛(wèi)生構(gòu)成了明顯威脅。2021年底，在丹麥、南非和印度等國的感染患者中發(fā)現(xiàn)了奧密克戎的另一譜系BA.2[4]。

2022年2 月開始，我國多地出現(xiàn)新冠病毒奧密克戎變異株引起的COVID-19疫情[5,6]。與其他新型冠狀病毒變異株相比，奧密克戎變異株引起重癥疾病的概率較低，癥狀以發(fā)燒、頭痛、流鼻涕、喉嚨痛等為主，但是奧密克戎變異株的傳播性更強[3]。SARS-CoV-2在流行傳播過程中，不斷出現(xiàn)傳播能力增強、抗體有效性降低及免疫逃避的新毒株，未來也將可能出現(xiàn)新的變異株，將高通量測序技術(shù)應(yīng)用到新冠病毒感染的疫情防控當(dāng)中，從基因組水平上了解病毒的分子學(xué)特征，對疫情防控及準(zhǔn)確的研判具有重要意義[7]。

本研究對貴陽市2022年9月一起由奧密克戎變異株引起的疫情中的6例無癥狀感染者鼻咽拭子樣本進(jìn)行新型冠狀病毒全基因組測序分析，為了解奧密克戎變異株的流行特征和進(jìn)化變異特點提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

2022年8月31 日，貴陽市在風(fēng)險職業(yè)人群定期監(jiān)測中發(fā)現(xiàn)1例新冠病毒核酸檢測結(jié)果異常，截止9月29日24時，該輪疫情累計報告確診病例230例，無癥狀感染者1543例。本研究收集到該輪疫情中6例本土新型冠狀病毒無癥狀感染者，采集鼻咽拭子樣本，并收集相關(guān)流行病學(xué)資料。

1.2 核酸提取與新型冠狀病毒核酸檢測

采用核酸提取及純化試劑盒（上海伯杰，磁珠法），取樣本200μl于對應(yīng)孔內(nèi)，使用全自動磁珠核酸提取儀（上海伯杰）進(jìn)行核酸提取。利用新冠病毒核酸檢測試劑（上海伯杰）對所獲得的核酸進(jìn)行新型冠狀病毒逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）檢測。

1.3 全基因組文庫構(gòu)建和測定

以提取的病毒 RNA 作為模板，使用ULSEN超高靈敏度新冠病毒全基因組捕獲試劑盒（低載量）（北京微未來）、Nextera XT Library Preparation Kit（Illumina，美國）、Nextera XT Index Kit（Illumina，美國）進(jìn)行文庫構(gòu)建。（1）使用ULSEN超高靈敏度新冠病毒全基因組捕獲試劑盒（低載量）（北京微未來）對新型冠狀病毒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及全基因組擴(kuò)增，再對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行濃縮、純化；（2）使用Nextera XT Library Preparation Kit（Illumina，美國）和Nextera XT Index Kit（Illumina，美國）進(jìn)行雙鏈DNA片段化和文庫構(gòu)建、純化及均一化；（3）采用Illumina Miseq 二代測序系統(tǒng)、Micro Miseq芯片及配套試劑（Illumina，美國）對構(gòu)建的文庫進(jìn)行全基因組測序。

1.4 全基因組序列拼接與比對

以NCBI數(shù)據(jù)庫中的新型冠狀病毒 Wuhan-Hu-1（NCBI Reference Sequence：NC_045512.2）基因組作為參考序列，使用MicronCoV Analyzer分析軟件（北京微未來科技有限公司）進(jìn)行新型冠狀病毒全基因組序列拼接及核苷酸變異位點檢測。應(yīng)用Pangolin（https://pangolin.cog-uk.io/）和Nextclade（https://clades.neststrain.org/）在線分析平臺，判定病毒譜系及型別，分析病毒的變異位點。

2 結(jié)果

2.1 樣本信息及核酸檢測結(jié)果

由于該輪疫情傳播鏈條較為復(fù)雜，不能確認(rèn)感染源，存在多條傳播鏈，初步流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示6例新型冠狀病毒無癥狀感染者之間不存在直接流行病學(xué)關(guān)聯(lián)。

6例感染者中，男2例，女4例；年齡最小10歲，最大68歲；在此次感染時，4例接種過新冠疫苗接種（均接種2劑及以上），2例未接種過新冠疫苗。經(jīng)新型冠狀病毒核酸檢測，6份樣本Ct值均小于30，詳情見表1。

表1 新冠病毒奧密克戎變異株無癥狀感染者樣本信息

表2 基因組測序基本情況

2.2 基因組測序基本情況

本研究共獲得6條覆蓋度大于99%的新型冠狀病毒全基因組序列，測序數(shù)據(jù)質(zhì)控合格，滿足分析要求，Nextclade分型結(jié)果顯示，6條均屬于21L型（Omicron）。Pangolin分型結(jié)果顯示（pangolin version：v 4.2），6條21L型（Omicron均屬于BA.2.76。

2.3 核苷酸及氨基酸變異分析

與新型冠狀病毒武漢株（NC_045512.2）相比，感染者1和4的新型冠狀病毒全基因組序列存在相同的76個核苷酸變異，分別為ORF1ab區(qū)25個（T670G，C1108T，C2790T，C3037T，G4184A，C4321T，C7528T，A9055G，C9344T，A9424G，C9534，C9866T，C10029T，C10198T，G10447A，C10449A，C12880T，C14408T，C15714T，C17410T，A18163G，G19009T，G19684T，C19955T，A20055G），S區(qū)30個（C21618T，G21987A，T22200G，T22304A，G22578A，G22599C，C22674T，T22679C，C22686T，A22688G，G22775A，A22786C，G22813T，T22882G，G22992A，C22995A，A23013C，A23040G，A23055G，A23063T，T23075C，A23403G，C23525T，T23599G，C23604A，C23854A，G23948T，A24424T，T24469A，C25000T），ORF3a區(qū)4個（C25416T，C25418A，C25584T，C26060T），E區(qū)1個（C26270T），M 區(qū)3個（C26577G，G26709A，C26858T），ORF6 區(qū)4個（A27259C，G27382C，A27383T，T27384C），ORF7區(qū)1個（C27807T），ORF8區(qū)1個（C27972T），N區(qū)5個（C28311T，G28881A，G28882A，G28883C，A29510C），非編碼區(qū)2個（C241T，A28271T）。

感染者2的新型冠狀病毒全基因組序列存在78個核苷酸變異，與感染者1、4的序列相比增加了2個突變位點（C44T、C7843T）。感染者3的新型冠狀病毒全基因組序列存在77個核苷酸變異，與感染者1、4的序列相比增加了1個突變位點（G26140T）。感染者5的新型冠狀病毒全基因組序列存在78個核苷酸變異，與感染者1、4的序列相比增加了2個突變位點（C44T、G25996T）；感染者6的新型冠狀病毒全基因組序列存在77個核苷酸變異，與感染者1、4的序列相比增加了1個突變位點（C1122T）。

與新型冠狀病毒武漢株（NC_045512.2）相比，感染者1、2、4的氨基酸變異位點為56個且完全相同，分別為E：T9I，M：Q19E、A63T，N：P13L、R203K、G204R、S413R，ORF1a：S135R、T842I、G1307S、L3027F、T3090I、L3201F、T3255I、P3395H，ORF1b：P314L、R1315C、I1566V、D1848Y、V2073L、T2163I，ORF3a：T9K、T223I，ORF6：D61L，ORF8：Q27，ORF9b：P10S，S：T19I、A27S、G142D、V213G、Y248N、G339D、R346T、S371F、S373P、S375F、T376A、D405N、R408S、K417N、N440K、S477N、T478K、E484A、Q493R、Q498R、N501Y、Y505H、D614G、H655Y、N679K、P681H、N764K、D796Y、Q954H、N969K。

感染者3的氨基酸變異位點為57個，與感染者1相比增加了1個突變位點（ORF3a: D250Y），感染者5的氨基酸變異位點為57個，與感染者1相比增加了1個突變位點（ORF3a:V202L），感染者6的氨基酸變異位點為57個，與感染者1相比增加了1個突變位點（ORF1a: P286L），詳見表3。

表3 位點變異情況

3 討論

新型冠狀病毒經(jīng)過在全球不同人群間突變進(jìn)化與新冠疫苗選擇壓力的雙重選擇下，已演變出多種不同的亞型或分支，包括Alpha、Beta、Gamma、Delta、Omicron及現(xiàn)目前主要流行的XBB系列變異株等[8,9]。截至目前，奧密克戎變異株是基因組突變數(shù)量最多的VOC（(Variants of concern，VOC)）。突變影響了其生物學(xué)特性，包括增強了病毒的復(fù)制能力和與宿主細(xì)胞受體的親和力，導(dǎo)致奧密克戎變異株具有更強的傳播性[4]。2021年11月11日，奧密克戎（BA.1）變異株首次在博茨瓦納被發(fā)現(xiàn)，隨后在丹麥、南非和印度等國的感染患者中發(fā)現(xiàn)了奧密克戎的另一譜系BA.2。研究表明，BA.2變異株的傳染性比BA.1變異株高30%，但不會引起更嚴(yán)重的疾病[10]。BA.2.76變異株屬于BA.2的第三個亞變體，于2022年7月首先由捷克報告，后續(xù)傳入印度、緬甸等多個國家，在我國四川、西藏、重慶等多地也引起了多起疫情[11]。由于本輪疫情傳播鏈復(fù)雜，且存在多條傳播鏈同時傳播的情況，無法通過分子溯源分析證實其是否存在流行病學(xué)關(guān)聯(lián)。通過在全球新冠病毒數(shù)據(jù)庫GISAID中比對，發(fā)現(xiàn)本研究中6例樣本與同時期國內(nèi)西藏、青海、四川病毒序列高度同源。本研究6例樣本均來自無癥狀感染者，因無同時期其他病例新冠病毒全基因組測序結(jié)果進(jìn)行比對，無法判斷無癥狀感染者樣本中BA.2.76變異株與有癥狀感染者樣本中BA.2.76變異株的變異區(qū)別，后續(xù)可進(jìn)行深入研究。

2023年5月5 日，世界衛(wèi)生組織宣布，新冠疫情不再構(gòu)成“國際關(guān)注的突發(fā)公共衛(wèi)生事件”，然而結(jié)束“國際關(guān)注的突發(fā)公共衛(wèi)生事件”并不意味著新冠疫情的結(jié)束，也并不意味著疫情危害就徹底沒有。隨著新冠病毒的不斷傳播及變異，仍需繼續(xù)做好新冠病毒的變異情況和疫情發(fā)生發(fā)展情況的監(jiān)測，做好預(yù)警和風(fēng)險的研判工作，保障群眾健康。