HPLC 法分析醋酸阿比特龍原料有關物質

王潞娜，王紅芳，柴青葉，申曉婷，宋小飛，張輝

山西振東制藥股份有限公司，山西 長治 047100

前列腺癌是一種常見的在男性泌尿生殖系統中的惡性腫瘤，該病的發生與性激素、遺傳等因素密切相關，中老年前列腺癌的發病率較高，可隨著病情的進展演變為去勢抵抗性前列腺癌（mCRPC），嚴重增加了治療難度［1］。而醋酸阿比特龍（abiraterone acetate）是一種不可逆靶向細胞色素酶P450（CYP）17 抑制劑［2-6］，臨床上主要用于治療既往接受含多烯紫杉醇（多西他賽）治療的mCRPC 患者，單獨使用時，具有選擇性強、親和力好、活性高的特點，可使mCRPC 患者臨床獲益，是目前歐美國家臨床治療mCRPC 的一線治療藥物。其與潑尼松聯合治療mCRPC 患者［7］，使患者的總生存期延長4.4 個月，且不良反應率顯著降低且可控［8-11］。2018 年國家藥品監督管理局批準了新適應證，與潑尼松或潑尼松龍合用可明顯延長患者總生長期，治療新診斷的高危轉移性內分泌治療敏感性前列腺癌（mHSPC）［12］，現已成為治療晚期前列腺癌首選藥物之一。

由醋酸阿比特龍原料藥性質及其合成工藝路線可知，原料需要研究的雜質包括：雜質A（氧化雜質）、雜質B（M3 傳遞）、雜質C（氧化/光照降解雜質）、雜質D（氧化/光照降解雜質）、雜質E（CSA-M3 剩余）、雜質F（異構體）、雜質G（與乙酸丙酸酐發生副反應）。

目前醋酸阿比特龍原料被美國藥典（USP43-M38）收錄［13］，美國藥典僅控制了雜質A、B、C、D、E，鑒于對原料藥的雜質譜研究尚不全面，本研究采用USP 方法對其進行驗證，發現色譜峰存在分離度差、峰型不佳、基線噪聲大等問題，故在美國藥典基礎上對其方法進一步優化，并根據ICHQ2(R1)分析方法驗證正文和方法學指導原則、中國藥典2020 年版四部通則9101《分析方法驗證指導原則》進行方法學驗證［14］，證明該方法能有效評價醋酸阿比特龍質量，同時為質量標準制定提供依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀（Agilent 1260 HPLC，DAD，美國安捷倫科技公司）；電子天平（TB-215D，北京賽多利斯科學儀器有限公司）；超純水機（Milli-Q，IQ7000，默克密理博merck）；ProntoSIL C18 色譜柱（3 mm×150 mm，3 μm，德國BISCHOFF）、Acclaim TMPolar Advantage Ⅱ（3 mm×150 mm，3 μm，德國BISCHOFF）。

1.2 試藥

醋酸阿比特龍，批號：2109201、2210201、2211202、2212203，山西振東泰盛制藥有限公司；乙酸銨（色譜級），上海阿拉丁生物科技有限公司；乙腈（色譜純），北京伊諾凱科技有限公司；無水乙醇（色譜純），默克股份兩合公司；氫氧化鈉（分析級），天津市永大化學試劑有限公司；鹽酸（分析級），國藥集團化學試劑有限公司；30%雙氧水（分析級），國藥集團化學試劑有限公司；雜質A 對照品（含量：97.3%，批號：LC-ABL-009，深圳市靈凌生物科技有限公司）；雜質B 對照品（含量：99.7%，批號：21155959A-WA-011，STD）；雜質C 對照品（含量：96.5%，批號：LC-ABL-15，深圳市靈凌生物科技有限公司）；雜質D 對照品（含量：95.8%，批號：2904-034AL，TCL）；雜質E 對照品（含量：99.9%，批號：WRS-CSA-M3-2111-041，自制）；雜質F 對照品（96.7%，批號：LC-ABL-006，深圳市靈凌生物科技有限公司）；雜質G 對照品（含量：96.5%，批號：WRS-CSA-APIi3-2111-044，自制）；醋酸阿比特龍對照品（含量：96.8%，批號：R078C0，USP Authoried Distributors）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

以ProntoSIL C18（3 mm×150 mm，3 μm）為色譜柱；以10 mmol/L 乙酸銨-乙腈（95∶5）為流動相A；以乙腈為流動相B；乙醇為流動相C；流速為0.35 mL/min；檢測波長為254 nm；柱溫為15 ℃；進樣量為10 μL；按下表進行梯度洗脫（見表1）。

表1 梯度洗脫程序

圖1 醋酸阿比特龍及雜質A、B、C、D、E、F、G化學結構

2.2 溶液配制

雜質A 對照品母液：取雜質A 對照品約2 mg，精密稱定，置20 mL 量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻（濃度約為100 μg/mL）；同法配制雜質B、C、D、E、F、G 對照品母液。

雜質A 對照品溶液：精密量取雜質A 對照品母液1 mL，置10 mL 量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻（濃度約為10 μg/mL）；同法配制雜質對照品溶液B、C、D、E、F、G。

系統適用性溶液：取樣品約10 mg，精密稱定，置10 mL 量瓶中，加乙腈適量使溶解，精密加入雜質A、B、C、D、E、F、G 對照品溶液各1 mL，用乙腈稀釋至刻度，搖勻（樣品濃度約為1 mg/mL、各雜質濃度約為1 μg/mL）。

供試品溶液：取樣品約10 mg，精密稱定，置10 mL 量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻（濃度約為1 mg/mL）。對照溶液：精密量取供試品溶液1 mL，置100 mL 量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻；精密量取1 mL，置10 mL 量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻（濃度約為1 μg/mL）。

2.3 系統適用性

取系統適用性溶液按“2.1”項下色譜條件進樣檢測，詳見圖2。由圖譜可知，醋酸阿比特龍與相鄰雜質峰之間、7 個已知雜質與相鄰雜質峰之間分離度均大于2.0；主峰理論板數按醋酸阿比特龍計算為67 611，不低于5 000；醋酸阿比特龍及7 個已知雜質拖尾因子均小于1.5。

2.4 專屬性

未破壞供試品溶液：配制同“2.2”項下供試品溶液。酸破壞溶液：取樣品約10 mg，精密稱定，置10 mL 量瓶中，加3 mL 乙腈使溶解，精密加入1 mol/L 鹽酸溶液0.5 mL，于室溫條件下放置8 h，精密加入1 mol/L 氫氧化鈉溶液0.5 mL，用乙腈稀釋至刻度，搖勻（濃度約為1 mg/mL）。同法配制相應空白溶液。酸破壞溶液：取樣品約10 mg，精密稱定，置10 mL 量瓶中，加3 mL 溶劑使溶解，精密加入1 mol/L 氫氧化鈉溶液0.5 mL，于室溫條件下放置1 h，精密加入1mol/L 鹽酸溶液0.5 mL，用乙腈稀釋至刻度，搖勻（濃度約為1 mg/mL）。同法配制相應空白溶液。氧化破壞溶液：取樣品約10 mg，精密稱定，置10 mL 量瓶中，加3 mL 溶劑使溶解，精密加入30%過氧化氫溶液1 mL，于50 ℃水浴鍋中放置5 min，用乙腈稀釋至刻度，搖勻（濃度約為1 mg/mL）。同法配制相應空白溶液。光照破壞溶液：取樣品適量，置扁形瓶中平鋪，厚度約5 mm，于可擴展試驗箱（5 000 Lx，0.9 wh·m-2）中放置10 d，取出置干燥器中；臨用前，取樣品約10 mg，精密稱定，置10 mL 量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻（濃度約為1 mg/mL）。高溫破壞溶液：取樣品適量，置扁形瓶中平鋪，厚度約5 mm，于105 ℃電熱鼓風干燥箱中放置8 h，取出置干燥器中，放冷至室溫；取樣品約10 mg，精密稱定，置10 mL 量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻（濃度約為1 mg/mL）。

按“2.1”項下進樣檢測，記錄各破壞條件下典型圖譜。結果表明：樣品在光照、高溫2 個條件下相對穩定，總雜含量及雜質個數無明顯變化；在酸、堿、氧化3個條件下相對不穩定，均有降解雜質生成，各降解雜質峰與主峰之間分離度均大于2.0，且能達到完全分離。

2.5 靈敏度

混合對照品溶液：取醋酸阿比特龍對照品，雜質A、B、C、D、E、F、G 對照品適量，加乙腈溶解稀釋制成10 μg/mL 的混合溶液。

取混合對照品溶液逐步稀釋制成一定濃度的溶液按“2.1”項下進樣檢測，雜質A、B、C、D、E、F、G 及主成分定量限（LOQ）測定結果分別為0.50 ng、0.31 ng、3.11 ng、2.92 ng、0.81 ng、0.99 ng、0.80 ng、0.49 ng，檢測限（LOD）測定結果分別為0.20 ng、0.13 ng、1.24 ng、1.17 ng、0.33 ng、0.40 ng、0.32 ng、0.20 ng；LOQ 溶液重復進樣6 針，雜質A、B、C、D、E、F、G 及主成分峰面積RSD 分別為4.02%、3.87%、6.47%、2.12%、5.47%、3.53%、5.14%、7.59%；保留時間RSD分別為0.17%、0.11%、0.07%、0.05%、0.08%、0.07%、0.13%、0.11%，結果表明靈敏度良好。

2.6 線性與范圍

線性1～6 溶液：取醋酸阿比特龍對照品、雜質A、B、C、D、E、F、G 對照品適量，加乙腈溶解并制成0.05 μg/mL、0.5 μg/mL、0.8 μg/mL、1.0 μg/mL、1.5 μg/mL、2.0 μg/mL 一系列溶液。主成分及各已知雜質以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標作圖，用最小二乘法進行線性回歸，計算回歸方程和回歸方程相關系數r，并以標準曲線法計算校正因子，結果見表2。

表2 醋酸阿比特龍及雜質A～G線性結果

2.7 回收率

將雜質限度作為100%點，測試50%、100%、150%3 個不同濃度點回收率；各雜質對照品溶液按“2.2”項下溶液配制方法制備；供試品溶液配制同“2.2”項下。

取樣品約10 mg，置10 mL 量瓶中，加適量溶劑溶解，分別精密加入“2.2”項下各雜質對照品溶液適量，加乙腈稀釋至刻度，搖勻（每個濃度平行配制3 份）。結果：雜質A 回收率為99.03%～103.92%，RSD 為1.84%；B 回收率為100.67%～106.00%，RSD為1.96%；C 回收率為91.49%～104.26%，RSD 為4.35%；D 回收率為98.70%～105.88%，RSD 為2.23%；E 回收率為96.08%～102.97%，RSD 為2.26%；F 回收率為94.00%～102.00%，RSD 為2.46%；G 回收率為96.18%～101.92%，RSD 為1.79%；9 份回收率溶液RSD 均小于5.0%，均符合要求。

2.8 重復性

照“2.2”項下平行配制6 份供試品溶液，按“2.1”項下進樣檢測，記錄峰面積，計算各雜質含量。雜質E、F、G 校正因子的值均在0.9～1.1 之間，雜質A、B 校正因子均小于0.9，故均采用不加校正因子主成分自身對照法；雜質C、D 校正因子均大于1.1（見表2），故均采用加校正因子主成分自身對照法。結果雜質F 未檢出、雜質A、B、C、D、E、G 含量均值分別為0.004%、0.001%、0.016%、0.005%、0.008%、0.010%，RSD 值分別為5.22%、3.92%、3.43%、4.83%、4.10%、3.82%，表明方法重復性良好。

2.9 中間精密度試驗

于不同日期、不同人員、采用不同儀器、重復“2.8”項下實驗。2 位分析人員，12 份供試品溶液結果統計結果顯示，雜質F 未檢出、雜質A、B、C、D、E、G 含量均值分別為0.004%、0.001%、0.015%、0.005%、0.009%、0.011%，RSD 值分別為5.18%、3.87%、3.52%、4.62%、4.23%、3.79%，表明方法精密度良好。

2.10 溶液穩定性

取“2.2”項下供試品溶液按“2.1”項下色譜條件分別在0 h、6 h、12 h、18 h、24 h、30 h、36 h、42 h 進樣檢測，記錄色譜圖；結果顯示，雜質F 未檢出，雜質A、B、C、D、E、G 不同時間點供試品溶液中各雜質含量均值分別為0.004%、0.002%、0.014%、0.003%、0.006%、0.014%；RSD 值分別為4.96%、3.95%、3.62%、4.72%、4.03%、3.89%，表明供試品溶液在室溫條件下42 h 內穩定。

2.11 耐用性

取“2.2”項下系統適用性溶液、供試品溶液按“2.1”項下色譜條件進樣檢測，通過改變柱溫（±2 ℃）、流速（±0.05 mL/min）、波長（±2 nm）、鹽濃度（±1%）、不同品牌色譜柱（AcclaimTM Polar Advantage Ⅱ，3 mm×150 mm，3 μm）等不同參數，對分析方法的耐用性進行評估；結果表明，對方法參數進行改變后，方法依然有效。

2.12 樣品檢測

取3 批不同批次原料藥，按“2.2”項下方法配制供試品溶液和對照溶液，依法檢測，檢測結果見表3。

表3 醋酸阿比特龍有關物質檢測結果 %

3 討論

3.1 校正因子參與計算的意義

對于特定雜質的控制，校正因子的研究和測定是非常必要的，它起到有效的校準作用，保證了雜質定量的準確性。校正因子的確定可采用單濃度點、多濃度點、標準曲線法和吸收系數比值法等計算。本研究中HPLC 測定采用標準曲線法測定其校正因子，利用線性方程中雜質斜率除以主成分斜率來計算各雜質的校正因子，同時還應該更換不同人員、于不同日期、采用不同儀器測試2 次，2 次的結果偏差不大于10%。如果校正因子數值在0.9～1.1，雜質計算時可采用不加校正因子主成分自身對照計算；當其大于1.1，小于0.9 時，雜質計算采用加校正因子主成分自身對照法計算。

3.2 流動相體系的優化

重現美國藥典USP43-NF38 項下有關物質色譜條件，檢測發現該方法無法將雜質B、C 有效分離，且雜質A、E 峰型較差，在優化方法時發現流動相A 組分及流動相洗脫比例對主峰及各雜質峰型、塔板數、拖尾因子有顯著影響，故通過將流動相A10 mmol/L乙酸銨更換為10 mmol/L 乙酸銨-乙腈（95∶5），且優化流動相洗脫比例，結果表明主成分及各雜質峰形、保留時間及各雜質分離情況均符合要求。

3.3 檢測波長的確定

取樣品（批號：2109201）與雜質A、B、C、D、E、F、G 適量，使用DAD 檢測器，在190 nm～400 nm波長范圍內進行全波長掃描，樣品與各已知雜質均在254 nm 波長處有較大吸收，因此選擇254 nm 為本方法檢測波長。

3.4 雜質限度的確定

參考美國藥典USP43-NF38 雜質標準與實際檢測結果，制定各雜質的限度標準。美國藥典2023年版規定各已知雜質限度為0.1%，均未對未知雜質及總雜限度進行規定，參考ICH 指導原則，根據每天攝入新原料藥的量及生產安全嚴格質控，擬定各已知雜質的限度不得過0.1%，未知單個雜質限度不得過0.10%，總雜質限度不得過3.0%。

4 小結

綜上可知，該方法經分析方法驗證，表明本方法專屬性強、靈敏度高、結果可靠、適用于醋酸阿比特龍原料中7 種有關物質檢測，為質量標準制定及安全生產提供了有效的技術保障。