基于生物信息學分析喹啉酸磷酸核糖基轉移酶在惡性黑色素瘤中的表達及潛在生物學功能

曹靜，路鵬霏，萬學峰#

新疆醫科大學第一附屬醫院1皮膚科，2腫瘤中心，烏魯木齊 830000

惡性黑色素瘤簡稱惡黑，是一種來源于黑色素細胞的惡性腫瘤，主要發生于皮膚，也見于皮膚-黏膜交界處、眼脈絡膜和軟腦膜等部位，具有惡性程度高、進展快、轉移早、預后差及病死率高等特點。皮膚惡性黑色素瘤約占皮膚惡性腫瘤的1%，病死例數占皮膚惡性腫瘤病死例數的80%以上[1]。近年來，惡性黑色素瘤的發病率在全世界呈上升趨勢，在西方國家中尤為顯著，目前已成為白種人最常見的惡性腫瘤之一[2]。近些年中國惡性黑色素瘤的發病率也逐漸上升，目前每年新發病例數2萬余例[3]。喹啉酸磷酸核糖基轉移酶（quinolinate phosphoribosyltransferase，QPRT）基因位于16 號染色體短臂，由35 421 個堿基對組成。QPRT 蛋白由297 個氨基酸組成，分子量為30 846 Da，是由3 個二聚體結合而成的六聚體，它是參與喹啉酸分解代謝的Ⅱ型磷酸核糖基轉移酶家族成員[4]。喹啉酸是色氨酸-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸途徑的中間產物，也是一種對神經元作用很強的內源性神經毒素，QPRT 對維持喹啉酸在大腦中的穩態必不可少[5]。有研究表明，QPRT 對神經退行性改變的反應增加，與癲癇、阿爾茨海默病和亨廷頓病等神經退行性疾病的發病機制有關[6]。有文獻報道，QPRT基因在甲狀腺腫瘤、肝細胞腫瘤及血液系統腫瘤等腫瘤性疾病中發揮作用[7-9]。本研究通過生物信息學方法分析QPRT基因在惡性黑色素瘤中的表達及潛在生物學功能，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 資料收集

應用癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）（http://cancergenome.nih.gov/）和基因表達綜合數據庫（Gene Expression Omnibus，GEO）（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/）檢索惡性黑色素瘤患者的臨床資料，如基本特征、治療過程、臨床分期、病理類型、生存情況以及組織標本中QPRTmRNA 及蛋白表達情況等。

1.2 QPRT mRNA 表達水平分析

利用基因表達譜互動分析（Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA）數據庫對TCGA 數據庫中惡性黑色素瘤組織和正常皮膚組織中QPRTmRNA 表達水平進行分析。利用UALCAN 數據庫（http://ualcan.path.uab.edu/）對TCGA數據庫中不同臨床分期惡性黑色素瘤患者惡性黑色素瘤組織中QPRTmRNA 的表達水平進行分析。

1.3 生存分析

應用GEPIA 數據庫分析不同QPRTmRNA 表達情況惡性黑色素瘤患者的預后。

1.4 QPRT 蛋白表達情況分析

應用人類蛋白質參考數據庫（Human Protein Reference Database，HPRD）分析正常皮膚組織、原發性黑色素瘤組織及轉移性黑色素瘤組織中QPRT 蛋白的表達情況。

1.5 蛋白質相互作用網絡

應用GeneMANIA 數據庫查找與QPRT 相互作用的蛋白。

1.6 基因功能分析

WebGestalt 是一個基因功能富集分析的在線網站，將與QPRT 相互作用的關鍵基因利用Web-Gestalt 進行基因本體（Gene Ontology，GO）分析，了解其參與的細胞組分、生物過程、生物功能。

1.7 統計學方法

采用SPSS 22.0 軟件對數據進行統計分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗；計數資料以例數和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，組間比較采用Logrank 檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 惡性黑色素瘤組織和正常皮膚組織中QPRT mRNA 表達水平的比較

通過GEPIA 數據庫在線分析TCGA 數據庫中461 例惡性黑色素瘤組織和558 例正常皮膚組織中QPRTmRNA 表達水平，結果發現，惡性黑色素瘤組織中QPRTmRNA 表達水平明顯高于正常皮膚組織，差異有統計學意義（P＜0.01）。（圖1）

2.2 不同臨床分期惡性黑色素瘤患者惡性黑色素瘤組織中QPRT mRNA 表達水平的比較

基于UALCAN 數據庫分析不同臨床分期惡性黑色素瘤患者惡性黑色素瘤組織中QPRTmRNA表達水平，結果顯示，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期惡性黑色素瘤患者惡性黑色素瘤組織中QPRTmRNA 表達水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。（圖2）

圖2 不同臨床分期惡性黑色素瘤患者惡性黑色素瘤組織中QPRT mRNA表達水平

2.3 不同QPRT mRNA 表達情況惡性黑色素瘤患者預后的比較

應用GEPIA 數據庫分析不同QPRTmRNA 表達情況惡性黑色素瘤患者的預后，以QPRTmRNA表達水平的中位數為界將458 例惡性黑色素瘤患者分為QPRT 高表達組（n=229）和QPRT 低表達組（n=229），結果顯示，QPRT 低表達組患者的總生存情況和無病生存情況均優于QPRT 高表達組，差異均有統計學意義（HR=1.3、1.3，P＜0.05）。（圖3）

圖3 不同QPRT表達情況惡性黑色素瘤患者的無病生存曲線和總生存曲線

2.4 惡性黑色素瘤組織中QPRT 蛋白表達情況

免疫組織化學檢測結果顯示，在正常皮膚組織中，QPRT 蛋白陰性表達（黑色素細胞中也為陰性），在惡性黑色素瘤組織中QPRT 蛋白呈強陽性表達，QPRT 蛋白主要在細胞質內均勻分布，呈棕褐色。在原發性黑色素瘤組織與轉移性黑色素瘤組織中，QPRT 蛋白均為強陽性表達。（圖4）

圖4 正常皮膚組織和惡性黑色素瘤組織中QPRT蛋白表達情況（免疫組化染色，×400）

2.5 QPRT 蛋白相互作用網絡預測及功能分析

GeneMANIA 數據庫共篩選出20 個與QPRT 相互作用的蛋白質：AC009133.22、支鏈α-酮酸脫氫酶（branched chain alpha-keto acid dehydrogenase kinase，BCKDK）、丙酮酸脫氫酶激酶4（pyruvate dehydrogenase kinase 4，PDK4）、載脂蛋白C1（apolipoprotein C1，APOC1）、組織蛋白酶D（cathepsin D，CTSD）、PTB 結合核蛋白2（ribonucleoprotein,PTB binding 2，RAVER2）、加工前體4（processing of precursor 4，POP4）、ATP 結合盒轉運蛋白亞家族C 成員1（ATP binding cassette subfamily C member 1，ABCC1）、PAT1 同源物1（PAT1 homolog 1，PATL1）、神經連接蛋白3（neuroligin 3，NLGN3）、抗氧化劑1 銅伴侶蛋白（antioxidant 1 copper chaperone，ATOX1）、TRAF3 結合蛋白2（TRAF3 interacting protein 2，TRAF3IP2）、甘氨酸脫氫酶（glycine decarboxylase，GLDC）、核蛋白1（nuclear protein 1，NUPR1）、紋蛋白4（striatin 4，STRN4）、核質蛋白α6（karyopherin subunit alpha 6，KPNA6）、核質蛋白β1（karyopherin subunit beta 1，KPNB1）、異檸檬酸脫氫酶1（isocitrate dehydrogenase 1，IDH1）、煙堿酸磷酸核糖基轉移酶（nicotinate phosphoribosyltransferase，NAPRT）、煙酰胺磷酸核糖基轉移酶（nicotinamide phosphoribosyltransferase，NAMPT），相互作用關系包括物理相互作用、共表達、共享蛋白質結構域、共定位等。（圖5）

圖5 GeneMANIA數據庫分析QPRT相互作用蛋白

2.6 GO 功能分析

對上述基因參與的生物過程、細胞組分、分子功能進行分析發現，這些蛋白主要參與了代謝過程、生物調節、定位等生物過程；QPRT相關基因位于多種細胞組分中，包括細胞質、細胞膜、細胞外間隙、內膜系統等；分子功能包括蛋白結合、離子結合、核酸結合、參與轉運體活動等。（圖6）

圖6 與QPRT相互作用關鍵基因的GO功能富集分析

3 討論

隨著高通量測序技術及微陣列雜交技術的迅速發展，產生了大量基因數據，包含腫瘤表觀組、基因組及轉錄組等信息。為了滿足研究人員信息共享的需求，多個基因數據庫應運而生，目前已廣泛應用于基因表達定量分析，為腫瘤研究提供了良好的平臺。本研究分析TCGA 數據庫中的芯片數據，探索惡性黑色素瘤中QPRT的表達水平。高通量測序技術具有自動化、低成本等特點，研究結果可靠，可用于發現新的具有較大意義的基因。近年來，RNA、蛋白質等在腫瘤中異常表達的研究較多，然而QPRT 在惡性黑色素瘤中的作用尚不清楚。

煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD，又稱NAD+），曾稱為二磷酸吡啶核苷酸或輔脫氫酶Ⅰ或氧化型輔酶Ⅰ，可傳遞電子，是體內很多脫氫酶的輔酶，連接三羧酸循環和呼吸鏈，其功能是將代謝過程中脫下來的氫傳遞給黃素蛋白，參與多種代謝活動[10]。QPRT 可催化喹啉酸生成煙酸單核苷酸，是輔酶NAD 從頭合成的前體，故QPRT 是調控三羧酸循環及呼吸鏈的重要酶。喹啉酸具有內源性神經毒性，既往研究已明確QPRT 在神經退行性疾病，如阿爾茨海默病、亨廷頓病等疾病中發揮重要作用。又有學者在孤獨癥譜系障礙（autism spectrum disorder，ASD）患者中發現QPRT基因變異，通過觀察抑制QPRT功能后神經母細胞瘤細胞的變化得出，QPRT 對SH-SY5Y 神經母細胞瘤細胞分化具有很強的調控作用，且存在因果關系，提示QPRT 在ASD 的發病機制中起重要作用[11]。

近年來，除神經系統疾病外，QPRT 在腫瘤相關疾病中的作用也逐漸被發現。Hinsch 等[7]對甲狀腺腫瘤患者的基因表達情況進行分析，結果發現，QPRT在濾泡性甲狀腺腺瘤和濾泡性甲狀腺癌中表達不同，并通過免疫組化法進行驗證，得出65%的濾泡性甲狀腺癌表達QPRT 蛋白，僅22%的濾泡性甲狀腺腺瘤表達QPRT 蛋白，提示QPRT 參與甲狀腺腫瘤的發生、發展過程，可能成為免疫組織化學篩查濾泡性甲狀腺結節的潛在標志物。Sahm 等[12]對腦膠質瘤的研究發現，QPRT 不僅在神經退行性疾病中發揮作用，也參與膠質瘤的進展，腫瘤惡性程度越高，QPRT 的表達水平也越高，并且在放化療后復發的膠質母細胞瘤中，QPRT 表達升高與預后不良有關。進一步研究發現，QPRT 高表達可增強腫瘤細胞對放化療誘導的氧化應激的抵抗力，發揮抗凋亡作用，從而導致預后較差，提示QPRT 可能成為腦膠質瘤的潛在治療靶點[13]。Wilms 腫瘤基因1（Wilms tumor gene 1，WT1）是一種轉錄因子，被認為是白血病的癌基因，QPRT是與WT1相關性最高的基因之一。Ullmark 等[8]研究QPRT 是否在白血病的發病中發揮作用，通過在白血病K562 細胞中過表達QPRT，發現細胞對抗白血病藥物伊馬替尼產生部分耐藥性，也提示QPRT可能具有抗凋亡功能，這與上述關于膠質瘤細胞的報道一致。有研究發現，QPRT可能是乳腺癌的促癌基因，可通過影響肌球蛋白輕鏈磷酸化促進乳腺癌侵襲[14]。另有研究發現，QPRT 在乳腺癌中表達上調，尤其是在人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）陽性乳腺癌中，明確了QPRT 是浸潤性乳腺癌的獨立預后因素，并且與免疫細胞浸潤息息相關[15-16]。在結腸癌中同樣發現QPRT 高表達與預后不良相關[17]。有研究發現，QPRT 蛋白在肝細胞癌患者組織間隙液中的表達水平明顯低于健康者，提示該蛋白參與了肝細胞癌的發生過程，但具體作用機制尚需研究[9]。此外，也有基因表達分析的研究顯示，QPRT基因在子宮平滑肌瘤中高表達，是正常子宮平滑肌的3.6倍[18]。

學者們逐漸開始關注QPRT基因在腫瘤相關疾病，尤其是惡性腫瘤相關疾病中的作用，但是在惡性黑色素瘤中的作用尚未有相關報道。本文通過整合公共數據庫發現QPRT 在惡性黑色素瘤組織中高表達，且QPRT 高表達與預后不良相關，雖然QPRT基因表達水平在不同臨床分期惡性黑色素瘤組織中未見明顯差異，但仍可能是區分腫瘤良惡性的重要標志物。雖然目前現有數據提示QPRT基因與腫瘤臨床分期、惡性程度無明確相關性，但其可對惡性黑色素瘤的診斷及預后評估提供參考，對腫瘤療效評價的作用仍需進一步探討。以上結果均提示QPRT基因參與惡性黑色素瘤的發生并發揮重要作用，猜測其可能的機制如下：①惡性黑色素瘤的惡性程度高，易發生侵襲、轉移等惡性生物學行為，這正是腫瘤細胞增殖活躍的表現，該基因參與調控三羧酸循環及呼吸鏈反應，為機體提供能量，參與機體新陳代謝，因此有可能通過QPRT基因表達上調為腫瘤細胞提供更多能量，使腫瘤細胞增殖活躍，促進其快速進展、轉移，導致預后不良。②結合既往學者研究，QPRT 高表達可增加腫瘤細胞對放療、化療的抵抗力，發揮抗凋亡作用，但其具體作用機制仍需進一步研究。

目前惡性黑色素瘤的治療仍以手術為主，同時積極探索新的治療方法，如免疫治療和靶向治療等。中國惡性黑色素瘤患者對靶向治療的反應與西方人群類似，但對免疫治療的反應不如西方人群[3]，因此國內也在積極開展惡性黑色素瘤方面的研究，以打破傳統治療的束縛。本文通過生物信息學分析發現，QPRT基因在惡性黑色素瘤中明顯高表達，可能成為潛在的治療靶點；免疫組化法檢測顯示，QPRT在惡性黑色素瘤組織中呈強陽性表達，提示該蛋白有望成為篩查惡性黑色素瘤的生物標志物；同時QPRT基因高表達與預后不良相關，可為惡性黑色素瘤的預后判斷提供新的參考依據。

綜上所述，QPRT基因在惡性黑色素瘤中高表達，其高表達與惡性黑色素瘤患者的預后不良相關，可能成為篩查惡性黑色素瘤的標志物及治療靶點。QPRT 可為惡性黑色素瘤的篩查診斷、靶向治療及預后評估提供新的探索方向。由于本研究參考的數據庫源于國外，而惡性黑色素瘤在不同人種、地區的發病率及類型差異較大，本課題組后續將進一步研究及驗證QPRT基因在中國惡性黑色素瘤患者中的表達情況。