固相萃取-高效液相色譜法測定豆豉制品中苯甲酸鈉和山梨酸鉀含量

單曉靜

（廣東美味鮮調味食品有限公司，廣東中山 528437）

豆豉制品營養豐富，富含優質蛋白質、不飽和脂肪酸等營養物質，受到眾多消費者的青睞[1]。但豆豉制品容易因微生物污染而腐敗變質，不容易保存[2]，不少廠家為了延長豆豉制品的貨架期，會選擇違規過量添加苯甲酸鈉、山梨酸鉀等防腐劑。

目前檢測調味品中山梨酸鉀和苯甲酸鈉的方法主要有液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）[3]、氣相色譜法（Gas Chromatography，GC）[4]、液質聯用法（High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，HPLC-MS）[5]。研究對象主要集中在醬油、醋等調味品，很少有涉及豆豉制品防腐劑檢測的方法研究。豆豉基體比較復雜，其中含有大量的色素、蛋白質、油脂等成分，直接對目標成分進行測定時存在較大干擾，會對儀器造成較大損耗，易損壞色譜柱。本文采用固相萃取小柱（Solid Phase Extraction，SPE）技術對豆豉樣品進行預處理，實驗結果表明，本方法與傳統方法相比，準確度高，重復性好，樣品基體無雜質干擾，適用于市面上的豆豉樣品苯甲酸鈉和山梨酸鉀含量檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豆豉制品：市售。

甲醇、乙腈、異丙醇（HPLC級，Merck）；苯甲酸鉀、山梨酸鈉標準品（aladdin）；HC-C18固相萃取小柱（CNW，10 mL，填料2 g）；其余試劑均為分析純；實驗用水為一級水。

Agilent 1200型高效液相色譜儀：美國安捷倫公司（配置自動進樣器、二極管陣列檢測器）；超聲發生器；CNW 12位固相萃取真空裝置。

1.2 色譜條件

色譜柱：Phenomenon Luna Cl8柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL；檢測波長：230 nm；流動相：甲醇∶乙酸銨溶液（20 mmol·L-1）=5∶95。

1.3 樣品處理

將豆豉樣品用攪拌器打碎，稱取2 g打碎后豆豉樣品于50 mL塑料具塞離心管中。加10%甲醇水溶液約20 mL，渦旋混勻5 min，將超聲儀溫度調至50 ℃，并將樣品置于超聲儀中超聲20 min，樣品取出放涼后分別加2 mL乙酸鋅和亞鐵氰化鉀溶液，用漩渦振蕩器混勻后6 000 r·min-1離心10 min。轉移水相層至50 mL玻璃容量瓶中，于殘渣中加10%甲醇水溶液20 mL，重復上述超聲和離心操作，將水相層轉移到同一50 mL玻璃容量瓶中。用0.01 mol·L-1鹽酸溶液將樣品溶液pH調節至4.0并定容至容量瓶刻度，混勻。將5 mL樣品溶液上樣到已活化的SPE固相萃取小柱，分別用5 mL水和5 mL 10%甲醇水溶液淋洗，然后用5 mL甲醇溶液洗脫目標物并將洗脫液接收到10.0 mL容量瓶，定容至刻度，混勻，待色譜分析。

1.4 標準溶液配制

精確稱取一定量的山梨酸鉀、苯甲酸鈉對照品，用甲醇稀釋配制混合標準系列工作液，濃度為1 mg·L-1、5 mg·L-1、10 mg·L-1、20 mg·L-1和50 mg·L-1。

1.5 結果定性定量

以目標物標準品的保留時間進行定性，外標法進行定量。以峰面積為縱坐標，溶液濃度為橫坐標在儀器工作站上作校正曲線，相關系數要求R2≥0.995，通過儀器工作站自動從校正曲線上讀取目標物濃度。

2 結果與分析

2.1 萃取劑的選擇

重點對比了用純水、10%甲醇水溶液、20%甲醇水溶液作為苯甲酸鈉和山梨酸鉀提取劑，發現用純水作為萃取劑，因豆豉中油脂含量較高，容易造成乳化，而且提取率不好，回收率低，而加入10%甲醇的水溶液能克服上述兩點不足，萃取率達到100%。20%甲醇水溶液因為有機相比例較高，在樣品溶液上樣固相萃取小柱時會造成目標物的部分洗脫，造成回收率偏低，故本文使用10%甲醇水溶液作為萃取溶劑。

2.2 固相萃取小柱方法條件優化

由于苯甲酸、山梨酸極性較弱，C18固相萃取柱對上述兩種物質的保留能力較強，樣品上柱后用少量水和10%甲醇水溶液淋洗柱子，去除部分雜質，再用高比例有機相洗脫目標物，可獲得較好的回收率，純化效果較好。本文采用甲醇、乙腈和異丙醇3種溶劑對目標物進行洗脫，考察其對目標物的洗脫效果。實驗結果表明，甲醇和乙腈的洗脫能力接近，目標物回收率較高，而異丙醇洗脫能力較差，回收率偏低。因此，本文選擇甲醇作為洗脫液，目標化合物被萃取柱吸附后，分別用5 mL水和5 mL 10%甲醇淋洗凈化，用甲醇洗脫目標化合物，上液相色譜分析后，得到的色譜圖如圖1所示。

圖1 豆豉加標樣品經凈化后在230 nm檢測波長下的苯甲酸（1）、山梨酸（2）的色譜圖

2.3 樣液pH對回收率的影響

實驗中發現樣液的pH會影響目標物在固相萃取小柱上的吸附，從而對方法回收率造成影響。將樣液pH調節成2.0、4.0、6.0、8.0共4個梯度，將4個梯度樣液分別進行上柱，按上述樣品處理方法進行預處理，上機測定，計算相關組分的回收率，結果見表1。

表1 不同pH梯度樣液回收率

由表1可知，當樣液pH≤4.0時，方法回收率在99.8%～101.3%，說明低pH能有效抑制苯甲酸鈉和山梨酸鉀的解離，使其在固相萃取柱上吸附牢固。當樣液pH＞4.0，目標物在水溶液中逐漸解離，不能很好地吸附在固相萃取柱上，造成回收率降低。

2.4 標準曲線線性范圍、回歸方程、方法檢測限及定量限

配制1～50 mg·L-1系列濃度梯度的標準工作液上機測定，回歸方程及相關系數R2見表2。進空白樣，以3倍信噪比對應目標物含量為檢出限，10倍信噪比對應目標物含量為定量下限，確定苯甲酸鈉、山梨酸鉀在豆豉制品中的方法檢出限及定量限如表2所示。

表2 山梨酸鉀、苯甲酸鈉的回歸方程、相關系數、檢出限和定量限

2.5 回收率與精密度

取空白樣品，每份2 g，共3組，分別定量加入苯甲酸鈉、山梨酸鉀標準物質溶液，加標濃度為400 mg·kg-1。按上述樣品處理方法進行預處理，上機測定，分別計算其回收率和精密度，回收率及精密度數據見表3。由表3可知，苯甲酸鈉、山梨酸鉀加標濃度為400 mg·kg-1時，苯甲酸鈉、山梨酸鉀加標回收率在98.7%～101.3%，相對標準偏差在0.81%～0.96%，方法回收率、精密度均符合方法學驗證中回收率在90%～107%、CV≤4.31%的要求，說明方法準確性高，重復性好。

表3 山梨酸鉀、苯甲酸鈉加標回收率及精密度

3 結論

采用固相萃取-高效液相色譜法對豆豉制品中苯甲酸鈉和山梨酸鉀含量進行了分析，在1～50 mg·L-1線性關系良好，加標回收率在98.7%～101.3%，相對標準偏差在0.81%～0.96%，滿足方法學驗證的要求。本方法準確度高，重復性好，樣品基體無雜質干擾，適用于市面上豆豉樣品中苯甲酸鈉和山梨酸鉀含量的檢測。